以Matrigel作為神經干細胞移植支架治療急性脊髓損傷的實驗研究.pdf

1、目的：
　　本研究旨在探討 Matrigel作為急性脊髓損傷后細胞移植支架材料的可行性。
　　主要方法：
　　1.取新生24 h的SD大鼠大腦海馬組織，在體外用無血清的神經干細胞培養(yǎng)液[成分為DMEM/ F12(1∶1)、20 ng/ ml EGF、20 ng/ ml bFGF、1% PS]進行擴增培養(yǎng)。加入胎牛血清使其自然分化，應用細胞免疫熒光技術對細胞進行鑒定。體外分別采用Matrigel、可吸收明膠海綿（abso

2、rbale sponge）、TCP/POC作為支架材料培養(yǎng)感染Ad-G FP腺病毒的NSCs，于培養(yǎng)后2 h、1 d、3 d、7 d、14 d在熒光顯微鏡下觀察細胞在不同支架材料中的存活情況。將Matrigel/ NSCs混合物接種至裸鼠皮下成瘤，對瘤體進行組織學分析觀察移植的NSCs在M atrigel中的生長和分化情況。
　　2.制備SD大鼠脊髓的Allen’s打擊損傷模型。將動物分為三組：PBS對照組（A組，于損傷位點注射P

3、BS），單純Matrigel組（B組，于損傷位點單純注射Matrigel），Matrigel/NSCs組（C組，于損傷位點植入Matrigel與NSCs的復合物）。暴露T10節(jié)段脊髓后予10×2.5g·cm的能量打擊。各組在SCI后7 d進行移植處理，C組將Matrigel與用PKH67綠色熒光染料標記的第三代NSCs（細胞密度為5×107/ml）在體外混勻后植入大鼠SCI后7 d的脊髓損傷位點，分別于移植后1d,7d,14d,28d在

4、激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察脊髓損傷部位移植NSCs的存活情況。術后通過BBB評分評估大鼠后肢運動功能，觀察8周；移植處理后4，8周取損傷段脊髓行HE染色和免疫組織學檢測，觀察和評估Matrigel對損傷脊髓以及移植細胞的作用。
　　結果：
　　1.新生鼠海馬組織中分離出的 NSCs具有較強的克隆能力，可形成細胞團，呈不規(guī)則球形，免疫熒光結果提示早期形成的神經球Nestin抗原呈陽性；加入血清促使其分化2周，細胞免疫熒光結果提

5、示分化后的細胞GFAP抗原、MAP2抗原呈陽性。
　　2.與 absorbale sponge和 TCP/POC兩種支架材料相比較，NSCs在Matrigel中的存活率以及存活時間優(yōu)于另外兩組，NSCs可在Matrigel中存活較長時間；免疫熒光結果提示 NSCs可在 Matrigel中分化為β-tubulin3陽性的神經元；裸鼠皮下成瘤瘤體病理學檢測結果提示Matrigel中神經細胞生長良好，并可見少許新生血管；組織免疫學檢測結

6、果提示移植的細胞可分化為β-tubulin3和MAP2陽性的神經元。
　　3. PKH67示蹤 NSCs結果示NSCs在脊髓損傷部位可存活較長時間。
　　4. C組各時相點BBB評分最高，與其他兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；A組與B組各時相點無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。植入處理4周時，脊髓組織HE染色結果顯示A組損傷部位神經組織液化壞死形成體積不等的空洞；B組損傷部位空洞被植入的Matrigel填補，Matri

7、gel中可見細胞生長；C組損傷部位空洞被植入的Matrigel填補，可見大量神經細胞在植入的 Matrigel中生長，且有少許血管生成。免疫組織學結果顯示：A組損傷部位無neun、NF-200、MAP2陽性的神經元，損傷部位邊緣可見較多Nestin陽性的神經干細胞和GFAP陽性的星形膠質細胞，損傷中心則無Nestin表達；在B、C組損傷部位可見Nestin、neun、NF-200、MAP2、GFAP陽性的神經細胞，C組表達多于B組。植入