siRNA干擾Slug基因表達對IEC-6細胞放射線敏感性影響.pdf

1、目的：通過研究siRNA干擾Slug基因表達對體外腸隱窩細胞IEC-6接受X線照射的敏感性影響及機制，探討 Slug基因對腸道干細胞的保護作用，為減輕正常腸道組織的輻射損傷尋求新的策略。
　　方法：（1）以體外培養(yǎng)的大鼠小腸隱窩上皮細胞 IEC-6為研究對象，針對已知的Slug基因的cDNA序列，設計并合成3條特異性序列（siRNA-Slug-1、siRNA-Slug-2、siRNA-Slug-3）和1條非特異性序列（siRNA-

2、NC）。（2）利用銳博生物公司提供的轉染技術對 IEC-6細胞進行瞬時轉染。將細胞分為三組，分別為：實驗組，陰性對照組和空白對照組。實驗組細胞轉染 siRNA-Slug小干擾RNA，陰性對照組轉染siRNA Negative Control（siRNA-NC），空白對照組不轉染任何小干擾RNA。（3）在熒光顯微鏡下觀察細胞的轉染效率，選擇最佳轉染濃度和轉染時間進行后續(xù)實驗。（4）采用Western blot法檢測各組細胞Slug基因被干

3、擾后在蛋白水平的表達變化，以及Slug基因被沉默的同時PUMA蛋白水平的表達變化。（5）通過CCK8實驗檢測沉默Slug基因聯(lián)合放療對IEC-6細胞增殖情況的影響。（6）流式細胞儀（FCM）檢測各組細胞的凋亡率。（7）克隆形成實驗觀察 IEC-6細胞的放射敏感性。（8）采用SPSS21.0和GraphPad Prism5軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料結果以?χ± S形式表示，數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4、
　　結果：（1）利用銳博生物公司提供的轉染技術能夠成功將siRNA-Slug瞬時轉染入IEC-6細胞。（2）利用Western blot成功篩選出干擾效果最好的siRNA-Slug。同時Western blot結果顯示：經(jīng)X線照射，實驗組細胞內(nèi)的Slug蛋白表達與陰性對照組和空白對照組相比明顯降低（P＜0.01）；實驗組細胞的 PUMA蛋白表達明顯高于陰性對照組和空白對照組（P＜0.01），且隨著實驗組細胞內(nèi)的Slug蛋白表達的

5、下調(diào)，PUMA的蛋白表達增高。（3）CCK8結果顯示在0~6Gy劑量范圍內(nèi)，隨著X線劑量的增加，細胞的增殖活性降低；在6Gy劑量下，實驗組與陰性對照組和空白對照組比較，生長抑制率明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。（4）流式細胞術顯示經(jīng)X射線照射后，與陰性對照組和空白對照組相比，實驗組細胞的凋亡率增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。（5）細胞克隆形成實驗表明，實驗組細胞的存活分數(shù)明顯低于陰性對照組和空白對照組，差異具有統(tǒng)計學