硼替佐米調(diào)控泛素連接酶E3家族成員表達水平對前列腺癌抑制作用的分析.pdf

1、目的:前列腺癌是危害全世界男性健康的首要惡性腫瘤之一，在歐美等西方國家前列腺癌的年發(fā)病率居男性腫瘤的第1位，死亡率居第2位，在我國，前列腺癌發(fā)病率已躍居為男性惡性腫瘤的第3位。前列腺癌常為隱匿發(fā)病，確診時多已經(jīng)發(fā)生浸潤或轉(zhuǎn)移，其高死亡率及高術(shù)后復(fù)發(fā)率主要與其易轉(zhuǎn)移有關(guān)，死于前列腺癌的患者中85％～100％合并遠處轉(zhuǎn)移。前列腺癌細胞最遠轉(zhuǎn)移部位是骨，晚期前列腺癌骨轉(zhuǎn)移十分常見。大多數(shù)發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的前列腺癌會發(fā)展為雄激素非依賴性前列腺癌，因

2、此常規(guī)的內(nèi)分泌治療效果不理想。目前針對發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的前列腺癌尚無有效的治療方法，預(yù)后極差，生存期一般短于2年。因此，深入探討前列腺癌發(fā)生機制，找尋治療前列腺癌關(guān)鍵靶點及切實有效的治療藥物迫在眉睫。泛素連接酶E3具有調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、穩(wěn)定質(zhì)膜蛋白、降解錯誤蛋白與抑癌因子等多種作用，參與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程。泛素連接酶E3 Smurf1、Smurf2及WWP1均包括一個C2區(qū)域，2-4個WW區(qū)域和一個HECT區(qū)域，故具有相似的功能與共同的特性。

3、大量的研究指出泛素連接酶E3家族成員與前列腺癌的發(fā)生、遷移、浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，如研究發(fā)現(xiàn)WWP1在多種侵襲性前列腺癌細胞株中高表達，而且下調(diào)WWP1表達水平可導(dǎo)致癌細胞生長抑制。硼替佐米是一種新型泛素-蛋白酶體通路抑制劑，目前主要作為抗多發(fā)性骨髓瘤藥物應(yīng)用于臨床，雖有研究發(fā)現(xiàn)硼替佐米可抑制前列腺癌發(fā)生及浸潤，且可抑制腫瘤遠處轉(zhuǎn)移，但具體量-效關(guān)系、時間-效果關(guān)系及其作用機制尚不明確，已有資料提示硼替佐米對泛素連接酶E3 Smurf1、

4、Smurf2及WWP1表達水平亦有調(diào)節(jié)作用。本研究旨在分析探討硼替佐米通過調(diào)控泛素連接酶E3 Smurf1、Smurf2及WWP1的表達水平，從而對前列腺癌細胞增殖發(fā)揮抑制作用，為Smurf1、Smurf2及WWP1作為前列腺癌治療新靶點及硼替佐米應(yīng)用于前列腺癌治療提供依據(jù)。
　　本研究應(yīng)用一系列實驗方法，通過檢測藥物處理對雄激素非依賴性人前列腺癌PC3細胞株的細胞增殖率、Smurf1、Smurf2及WWP1 mRNA及蛋白表達水

5、平的影響，進而探索硼替佐米對前列腺癌細胞增殖的作用模式及機制。
　　方法:
　　1、細胞培養(yǎng)在嚴格無菌的環(huán)境下，將人前列腺癌PC3細胞接種于含DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，隔日換液，待細胞匯合度達90～95％時，以胰蛋白酶進行消化，并進行傳代培養(yǎng)，待傳至3-5代后取細胞進行實驗。
　　2、分組
　　2.1空白對照組（不進行任何藥物處理）;

6、r>　　2.2硼替佐米處理組(硼替佐米濃度梯度設(shè)置為:0.5、5、15、25μmol/L，作用時間:24h、48 h，72 h)
　　3、細胞增殖率測定采用Brdu ELISA法測定各組細胞增殖情況及其活性變化。
　　4、細胞泛素連接酶Smurf1、Smurf2及WWP1 mRNA水平測定硼替佐米處理PC3細胞72小時后，提取細胞內(nèi)RNA。應(yīng)用實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)(Real time-PCR，Real Time-Polym

7、erase Chain Reaction)對各組細胞泛素連接酶WWP1、Smurf1及Smurf2 mRNA水平進行檢測。
　　5、細胞泛素連接酶Smurf1、Smurf2及WWP1蛋白表達水平測定硼替佐米處理PC3細胞72小時后，提取蛋白并采用BCA法測定蛋白濃度。應(yīng)用Western blotting方法對各組細胞泛素連接酶Smurf1、Smurf2及WWP1蛋白表達水平進行檢測。
　　6、統(tǒng)計學(xué)方法本研究所得數(shù)據(jù)均錄入S

8、PSS18.0軟件進行分析處理，計量資料均以“均數(shù)±標準誤”表示，應(yīng)用SNK-t檢驗法進行兩組比較，單因素方差分析AVON進行多組比較，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、Brdu ELISA結(jié)果顯示:
　　1.1于藥物處理后24 h、48 h及72 h三個時間點，相較于對照組，硼替佐米處理組PC3細胞增殖率均顯著降低(P＜0.05)，且PC3細胞增殖率與硼替佐米使用劑量負相關(guān)，即硼替佐米濃度越高

9、，對PC3細胞增值率抑制作用越強，PC3細胞增值率數(shù)值越低，呈現(xiàn)劑量依賴性，且在25μmol/L的濃度下抑制作用最為顯著;
　　1.2在藥物濃度分別為5、15及25μmol/L的硼替佐米處理組中，PC3細胞增值率與處理時間長短負相關(guān)，即硼替佐米處理時間越長，對PC3細胞增值率抑制作用越強，PC3細胞增值率數(shù)值越低，呈現(xiàn)時間依賴性。
　　2、Real time-PCR結(jié)果顯示:
　　經(jīng)藥物處理72 h后，相較于對照組，硼

10、替佐米處理組PC3細胞中Smurf1、Smurf2及WWP1 mRNA水平顯著降低(P＜0.05)，且在一定范圍內(nèi)Smurf1、Smurf2及WWP1 mRNA水平與硼替佐米使用劑量負相關(guān)，即硼替佐米濃度越高，PC3細胞中Smurf1、Smurf2及WWP1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平越低，呈現(xiàn)劑量依賴性，且在25μmol/L的濃度下效果最為顯著。
　　3、Western blotting結(jié)果顯示:
　　經(jīng)藥物處理72 h后，相較于對

11、照組，硼替佐米處理組PC3細胞中Smurf1、Smurf2及WWP1蛋白表達水平顯著降低(P＜0.05)，且在一定范圍內(nèi)Smurf1、Smurf2及WWP1蛋白表達水平與硼替佐米使用劑量負相關(guān)，即硼替佐米濃度越高，PC3細胞中Smurf1、Smurf2及WWP1蛋白表達水平越低，呈現(xiàn)劑量依賴性，且在25μmol/L的濃度下效果最為顯著。
　　結(jié)論:
　　1、硼替佐米對雄激素非依賴性人前列腺癌PC3細胞增殖率的抑制作用在一定范