TLRs與wnt-β-catenin信號通路在結腸癌細胞增殖中的crosstalk.pdf

1、目的：研究TLRs的激活介導wnt/β-catenin信號通路活化，促進結腸癌細胞的增殖；同時探討TLRs在結腸癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用及其可能的機制。
　　方法：為了闡明TLRs活化對腫瘤的影響，通過體外培養(yǎng)結腸癌細胞系HT-29，檢測TLRs及wnt/β-catenin表達情況，通過過表達TLRs及siRNA等手段研究TLRs與wnt/β-catenin信號通路的相互關系，探討TLRs對wnt/β-catenin信號通路激活、促

2、進結腸癌的生長及浸潤。1) LPS刺激結腸癌細胞系HT-29，隨后用RT-PCR檢測TLRs與Wnt/β-catenin信號通路相關基因mRNA的表達水平；2)LPS與順鉑聯合處理HT-29細胞，通過MTT方法檢測細胞增殖情況，繼而確定LPS及DDP的最適作用濃度及時間，建立TLRs活化對細胞耐受的藥物模型；3)按照藥物模型建立方法，給予細胞藥物處理后48h，RT-PCR及Western Blot檢測藥物模型中各組細胞wnt/β-cat

3、enin信號通路相關基因：wnt、β-catenin、P-GSK-3β表達變化，Toll樣受體及其相關炎性因子IL-6/TNF-α改變；4) NF-κB熒光素酶報告基因轉染細胞后，按照藥物模型建立方法，給予細胞藥物處理，最后檢測模型中各組NF-κB的活化情況；5）siRNA抑制TLR4的信號通路后，Western Blot檢測wnt/β-catenin信號通路相關基因的改變。
　　結果：
　　1)RT-PCR結果顯示LPS刺

4、激HT-29細胞后TLRs（TLR1-10）表達發(fā)生了不同程度改變，其中TLR2、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8、TLR9等TLRs表達出現不同程度的升高，且 TLR2、TLR4mRNA水平表達上調最為明顯；而Wnt/β-catenin信號通路相關基因表達表現為： GSK-3β下調，WNT及β-catenin上調;
　　2)MTT結果：不同濃度的LPS刺激HT-29細胞，對細胞產生不同程度的抑制或者增殖作用，而當同時給予不

5、同濃度DDP處理后，發(fā)現0.5μg/ml濃度的LPS，能有效的抵抗5μg/ml DDP對HT-29細胞的殺傷作用。根據上述結果建立0.5μg/mlLPS處理組、5μg/mlDDP處理組、陰性對照組、LPS聯合DDP處理組的藥物模型；
　　3）RT-PCR及Western Blot結果：藥物模型組中，與陰性對照組比較，LPS處理組p-GSK-3β表達下調，β-catenin表達上調，DDP組可抑制細胞增殖，同時p-GSK-3β表達上

6、調，β-catenin表達下調，wnt/β-catenin信號通路被抑制；而聯合用藥組，wnt/β-catenin信號通路相關基因表達改變程度低于DDP組；同時，DDP組TLR2、TLR4、TLR7、TLR8、TLR9、IL-6和TNF-α表達明顯下降，反映TLRs的活化受到抑制，而聯合用藥組TLRs表達下調程度明顯小于DDP組；
　　4） NF-κB熒光素酶報告基因結果顯示：LPS組相對熒光值明顯高于其它處理組，而DDP組相對熒

7、光值水平最低，聯合用藥組高于DDP組，提示LPS能通過激活NF-κB信號從而抑制順鉑引起的細胞凋亡4)siRNA抑制TLR4的信號通路后， P-GSK-3β表達升高，而β-catenin表達出現下調。
　　結論：本實驗結果表明LPS能夠通過活化TLRs信號通路從而介導wnt/β-catenin通路的活化，從而干預順鉑引起的HT-29細胞凋亡；這些結果提示TLR4/NF-κB信號通路的活化，IL-6和TNF-a等炎性因子釋放，能夠介