去泛素化酶USP10調控AMPK的功能和作用機制研究.pdf

1、AMPK（5’AMP-activated protein kinase）即AMP依賴的蛋白激酶，是生物能量代謝調節(jié)的關鍵分子。AMPK作為細胞能量感受器，其激活后可通過開啟ATP的補償機制和關閉ATP的消耗進程，恢復細胞內的能量平衡。AMPK參與調控多種細胞代謝進程，因此，其信號途徑是研究肥胖、2型糖尿病等代謝性疾病的核心。
　　AMPK的活性受到嚴格調控。當外界能量應激造成ATP減少，AMP/ATP比值增加，AMP可通過結合AM

2、PKγ亞基，促進AMPK上游激酶（AMPKK）對AMPK第172位點的蘇氨酸進行磷酸化，進而激活AMPK。當前，對AMPK激活調控多集中在對該位點的磷酸化修飾研究上，而其它類型的翻譯后修飾是否參與AMPK的激活還未見報道。本實驗室前期研究發(fā)現去泛素化修飾在AMPK激活過程中發(fā)揮重要作用，且鑒定了首個 AMPK去泛素化酶 USP10，同時發(fā)現USP10-AMPK通路受到精細的調控。因此，對USP10-AMPK信號通路的研究將為闡明AMPK

3、信號通路的作用機制提供一條新的線索，具有非常重要的意義。
　　本文的研究內容及結論主要包括以下兩個方面：
　?。ㄒ唬︰SP10調控AMPKα泛素化及其活性。1）在AMPK激活劑AICAR刺激條件下，我們發(fā)現AMPK的激活伴隨著其自身泛素化修飾水平的下降；2）通過生物信息學的方法分析USP10序列，我們鑒定了AMPKα上4個潛在泛素化位點。點突變實驗證實這些位點的泛素化受到USP10調控；4）通過免疫印跡檢測 AMPK下游底物

4、 ACC1，Raptor的磷酸化，我們發(fā)現 USP10的敲除抑制了AMPK的激活及其功能；油紅O染色證明，USP10敲除導致脂滴形成顯著提高；5）對USP10序列分析，我們發(fā)現USP10存在AMPK的潛在磷酸化位點Ser76。利用AMPK磷酸化通用底物抗體檢測USP10磷酸化，我們發(fā)現能量應激上調胞內USP10的磷酸化；體外激酶實驗進一步證明，AMPK可特異性磷酸化USP10；6）USP10敲除細胞中回補USP10野生型與S76突變體，

5、實驗證明USP10 S76位點的磷酸化促進其激活AMPK。
　?。ǘ┬∈蟾闻K特異性敲除USP10導致多種代謝損傷。1）我們利用CRISPR-Cas9技術構建 USP10肝臟特異性敲除小鼠模型，T7EN1酶切及免疫印跡檢測USP10肝臟敲除效率；2）對小鼠表型檢測，我們發(fā)現在肝臟內USP10的特異性敲除降低了AMPK的活性及其下游底物磷酸化。3）此外，USP10肝臟敲除小鼠表現出多種代謝缺陷，如甘油三酯、膽固醇及血糖含量明顯升高。

6、高胰島素-正血糖鉗夾實驗證實，USP10敲除小鼠的葡萄糖灌注速率明顯下調。
　　綜上所述，我們的研究發(fā)現了在能量應激下，一種放大 AMPK激活信號的關鍵分子機制。我們發(fā)現AMPKα的泛素化會抑制其激活，而去泛素化酶USP10可以特異性的去泛素化AMPKα激活AMPK。在能量應激下，AMPK反過來磷酸化USP10絲氨酸76位點，提高USP10的活性。因此，AMPK與USP10之間形成一種反饋調控回路，確保能量應激下，AMPK激活信號

7、的放大。小鼠敲除模型證明，對這種反饋調控回路的干擾，會導致 AMPK的激活異常及多種代謝缺陷的發(fā)生。
　　我們的研究揭示了泛素化修飾在 AMPK活性調控中的新功能，進一步加深了我們對AMPK活性調控機制的理解，同時擴展了我們對于AMPK翻譯后修飾新功能的認識。AMPK由于其重要功能已經成為肥胖，胰島素抵抗，2型糖尿病，代謝綜合征，甚至腫瘤等多種疾病的理想治療靶點。AMPK激活劑如二甲雙胍已經應用于胰島素抵抗，2型糖尿病的臨床治療。

8、鑒于USP10在AMPK激活中的重要作用，其有望為成為上述代謝性疾病的治療靶標。
　　第二部分
　　c-ABL（ Abelson tyrosine kinase）是一種非受體酪氨酸激酶，其可與 bcr（breakpoint cluster region）基因發(fā)生融合突變，形成具有高度酪氨酸激酶活性的BCR/ABL融合蛋白。這種突變是造成慢性髓質白血?。–ML）的根本原因。
　　BCR/ABL酪氨酸激酶抑制劑（TKI）已

9、經作為治療慢性髓質白血?。–ML）的一線藥物。然而在臨床治療中，患者對 imatinib及其它 TKI的耐藥性已成為CML治療面臨的新問題。當前，對 imatinib耐藥性潛在的分子機制還不十分清楚。本實驗室前期研究發(fā)現有絲分裂調控蛋白 PLK1（Polo-like kinase-1）是 c-ABL的一個重要的激酶底物。c-ABL可以與PLK1相互作用并磷酸化PLK1，促進細胞周期進程及細胞增殖。同時，c-ABL介導的PLK1過表達與白

10、血病患者的imatinib耐藥性正相關。因此，對c-ABL-PLK1信號通路的研究不但可以進一步拓展人們對細胞周期調控機制的認識，而且可能為CML及其它腫瘤的治療提供新的組合用藥策略。
　　本文的研究內容及結論主要包括以下四個方面：
　　（一）c-ABL調控PLK1蛋白降解及其活性。我們發(fā)現c-ABL磷酸化PLK1，抑制其泛素化降解并提高其活性。1）利用免疫共沉淀與GST-pull down分析，我們證明c-ABL可以與PL

11、K1在體內體外發(fā)生直接相互作用；2）通過找尋二者相互作用區(qū)域，我們發(fā)現 PLK1通過 PBD結構域與 c-ABL結合；c-ABL通過SH2/SH3，PTKs結構域與PLK1相互作用；3）激酶磷酸化實驗證明，c-ABL可以體內體外磷酸化PLK1；通過質譜鑒定，我們發(fā)現c-ABL磷酸化PLK1 Y217， Y425，Y445位點4）過表達c-ABL促進PLK1蛋白水平表達；敲除c-ABL抑制PLK1蛋白水平表達；利用放線菌酮阻抑證明c-AB

12、L抑制PLK1降解；蛋白酶體抑制劑及泛素化實驗證明，c-ABL抑制PLK1通過泛素化降解；點突變實驗證明， c-ABL通過Y425位點調控PLK1蛋白穩(wěn)定性；5）同步化細胞于有絲分裂期，我們證明c-ABL通過磷酸化PLK1 Y425位點促進PLK1的激活。體外磷酸化反應證明，PLK1 Y425位點的磷酸化促進Aurora A對其激活。
　?。ǘヽ-ABL磷酸化PLK1調控有絲分裂進程。1）流失細胞儀檢測c-ABL敲低HeLa細胞

13、，我們發(fā)現c-ABL影響細胞周期進程；2）免疫熒光及流式細胞儀檢測PLK1野生型與Y425突變株細胞周期，發(fā)現Y425磷酸化影響細胞G2/M轉換；3）激光共聚焦顯微鏡實時觀察細胞，進一步確定c-ABL介導的PLK1 Y425磷酸化促進細胞進入有絲分裂。
　　（三）c-ABL-PLK1軸影響 CML化療應答。1）Real-Time PCR及 Western Blot檢測臨床CML患者外周血樣本，發(fā)現BCR/ABL與PLK1在CML中

14、高表達；與 imatinib敏感患者相比，PLK1在 imatinib抗性患者體內表達更高；2） imatinib有效降低臨床患者CML中PLK1蛋白表達水平；3）K562細胞過表達PLK1抑制其對imatinib的化療應答；4）c-ABL與PLK1抑制劑聯合用藥顯著提高CML細胞的化療應答；5）構建imatinib抗性CML小鼠模型，證實聯合用藥延長CML腫瘤模型小鼠存活時間。
　?。ㄋ模ヽ-ABL-PLK1軸影響宮頸癌腫瘤增殖

15、及病人存活率。1）通過收集臨床宮頸癌組織樣本，發(fā)現 c-ABL與 PLK1在宮頸癌中高表達，同時在腫瘤組織中PLK1具有高度酪氨酸磷酸化修飾；2）裸鼠成瘤實驗證明，PLK1 Y425位點突變抑制腫瘤增殖；3）臨床隨訪數據證明，PLK1酪氨酸磷酸化與不良預后正相關；4）聯合用藥實驗證明，c-ABL，PLK1抑制劑促進宮頸癌細胞的化療應答。
　　綜上所述，我們的研究揭示了c-ABL-PLK1軸在有絲分裂進程及CML化療應答中的重要功能