靶向COX-2，AKT1和PI3Kp85基因的RNAi抑制胃腺癌SGC7901細(xì)胞侵襲遷移的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:構(gòu)建針對(duì)腫瘤相關(guān)基因AKT1、COX-2和PI3Kp85基因的shRNA重組腺病毒質(zhì)粒表達(dá)載體,檢測(cè)其在胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901中對(duì).AKT1、COX-2和P13Kp85基因表達(dá)的抑制作用,以及敲低靶基因的表達(dá)后,觀察MMP-2、MMP-9、TIMP-2和VEGF的表達(dá)變化。在體外實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移活性的變化,并進(jìn)一步探討COX-2和P13K/AKT信號(hào)通路在胃腺癌侵襲遷移過(guò)程中的作用機(jī)制。
　　 方法:本課

2、題分兩部分進(jìn)行:
　　 第一部分:設(shè)計(jì)可形成小干擾RNA的AKT1、COX-2和PI3Kp85shRNA對(duì)應(yīng)模板DNA序列,克隆至線性化質(zhì)粒PEGFP6-1、PGENESIL-2、PEGFP6-4上,構(gòu)建一個(gè)編碼AKT1、COX-2和PI3Kp85三條shRNA的質(zhì)粒表達(dá)載體。將此質(zhì)粒亞克隆至腺病毒表達(dá)載體上,經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定正確后包裝擴(kuò)增并鑒定其病毒滴度,然后轉(zhuǎn)染至SGC7901細(xì)胞中檢測(cè)其轉(zhuǎn)染率。
　　 第二部分:在

3、體外應(yīng)用RNA干涉技術(shù),以構(gòu)建的重組腺病毒介導(dǎo)靶向AKT1、COX-2和PI3Kp85的shRNA轉(zhuǎn)染人胃腺癌細(xì)胞系SGC-7901后,應(yīng)用RealtimePCR和Westernblot法檢測(cè)目的基因的敲低情況,并用Westernblot法檢測(cè)RNAi敲低靶基因的表達(dá)后,COX-2及EGFR通路下游侵襲相關(guān)因子MMP-2、MMP-9、TIMP-2和VEGF的蛋白表達(dá)變化。應(yīng)用ELISA檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后分泌到細(xì)胞外的MM9-2和MMP-9的濃

4、度變化。應(yīng)用劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)、2-D和3-D的Matrigel基質(zhì)生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后侵襲遷移能力的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.通過(guò)應(yīng)用定向克隆、同源重組等技術(shù),獲得一種同時(shí)包含靶向COX-2、PI3Kp85和AKT1三條RNA干擾序列的真核表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)酶切分析,測(cè)序鑒定表明構(gòu)建成功后,擴(kuò)增并亞克隆至重組腺病毒載體上,獲得重組腺病毒質(zhì)粒表達(dá)載體rAd5-C-A-P。由于重組腺病毒質(zhì)粒表達(dá)載體上

5、帶有熒光蛋白表達(dá)框,所以通過(guò)轉(zhuǎn)染SGC-7901后觀察熒光蛋白表達(dá)情況,計(jì)算轉(zhuǎn)染率>90％。
　　 2.RealtimePCR和Westernblot結(jié)果提示,轉(zhuǎn)染AKT1、COX-2和PI3Kp85shRNA后可明顯敲低靶基因mRNA和蛋白的表達(dá)。在靶基因被下調(diào)后通過(guò)Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)COX-2及PI3K/AKT信號(hào)通路下游侵襲相關(guān)因子MMP-2、MMP-9和VEGF的表達(dá)水平均明顯降低,而TIMP-2表達(dá)上調(diào)。應(yīng)

6、用ELASA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)rAd5-C-A-P轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)液中MMP-2和MMP-9明顯減低,劃痕實(shí)驗(yàn)顯示與對(duì)照組和無(wú)義序列組相比,rAd5-C-A-P轉(zhuǎn)染組細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)能力明顯減弱,Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)照組和無(wú)義序列組穿過(guò)細(xì)胞數(shù)分別為(105±4)、(102.5±6.4),而rAd5-C-A-P轉(zhuǎn)染組(26.4±4.6)(p<0.001)。2-D的Matrigel基質(zhì)生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)顯示對(duì)照組和無(wú)義序列組細(xì)胞呈正常形態(tài)貼壁生長(zhǎng)

7、并融合成片,而rAd5-C-A-P轉(zhuǎn)染組細(xì)胞貼壁能力與遷移能力均明顯減低,3-D的Matrigel基質(zhì)生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)顯示與對(duì)照組和無(wú)義序列組比較,rAd5-C-A-P轉(zhuǎn)染組細(xì)胞形成的細(xì)胞團(tuán)塊較小(p<0.001)。
　　 結(jié)論:
　　 1.成功構(gòu)建靶向AKT1、COX-2和PI3Kp85的重組腺病毒質(zhì)粒表達(dá)載體,其能在體外高效轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞。
　　 2.靶向.AKT1、COX-2和PI3Kp85的RNA干擾技術(shù)可以序列特