熱休克蛋白27在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其對化療敏感性影響的實驗研究.pdf

1、第一部分：熱休克蛋白27(HSP27)在單純?nèi)橄僭錾?、不典型增生及乳腺癌中的表達及其意義 目的:采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)技術(shù)檢測并比較HSP27mRNA在單純?nèi)橄僭錾⒉坏湫腿橄僭錾鷥煞N具有不同惡變風險的乳腺病變及乳腺癌中的表達，探討HSP27在乳腺組織惡性轉(zhuǎn)化過程中的作用，并分析其表達水平與乳腺癌各病理指標間的關(guān)系。 方法:收集2004.12-2005.06期間在齊魯醫(yī)院診治的68例乳腺癌患者的癌

2、組織及癌旁正常組織標本，并記錄術(shù)后病理診斷中腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目和ER、PR、Her2的表達情況；同時收集同期內(nèi)15例乳腺不典型增生組織、27例單純?nèi)橄僭錾M織。應用RT-PCR技術(shù)檢測上述標本中HSP27 mRNA的表達，在凝膠成像系統(tǒng)下分析電泳條帶，HSP27表達的相對值=HSP27條帶光密度值/β-actin條帶光密度值，半定量分析HSP27 mRNA在單純?nèi)橄僭錾?、不典型增生、乳腺癌及配對的癌旁組織中的表達情況。 結(jié)

3、論:不典型增生和乳腺癌中HSP27的表達明顯增強，乳腺癌中HSP27的表達與ER顯著相關(guān)，提示HSP27的過度表達在乳腺癌形成的早期就存在，并可能在部分乳腺癌，尤其是ER陽性乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起促進作用，HSP27可為探討乳腺癌發(fā)生機制、高危病例篩選提供一種新的途徑，可能成為乳腺癌預防和治療中新的靶點。 第二部分：熱休克蛋白27真核表達載體的構(gòu)建與鑒定 目的:構(gòu)建重組人HSP27真核表達載體，并檢測其在MDA-MB

4、-231細胞中的表達，為研究HSP27在乳腺組織惡性轉(zhuǎn)化過程中的作用及其對乳腺癌生物學行為的影響做準備。 方法:從高表達HSP27的人乳腺癌細胞MCF-7中提取總RNA，RT-PCR法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。設(shè)計擴增產(chǎn)物含有HSP27基因CDS序列的一對引物(上游引物:5'-AAGCTTCTGAGCAGACGTCCAGAGCA-3'，下劃線部分為HindⅢ酶切位點；下游引物：5'-GGATCCGCATCCGGGCTAAGGCTTT-

5、3'，下劃線部分為BamH Ⅰ酶切位點)，調(diào)取目的基因片段，與T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5α，篩選菌落并抽提質(zhì)粒。測序正確后，雙酶切克隆進入真核表達載體pCDNA3.1/myc-His(+)A中，得到重組質(zhì)粒．pCDNA3.1-HSP27。用此重組真核表達載體轉(zhuǎn)染低表達HSP27的人乳腺癌細胞MDA-MB-231，采用RT-PCR和Western blot技術(shù)分別從mRNA和蛋白水平鑒定重組質(zhì)粒在細胞中的表達。 結(jié)論:含人H

6、SP27全長CDS序列的pCDNA3.1-HSP27真核表達載體構(gòu)建成功，并在MDA-MA-231細胞中獲得高效表達，為進一步研究HSP27在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用奠定了基礎(chǔ)。 第三部分：熱休克蛋白27對乳腺上皮細胞HBL-100和乳腺癌細胞MDA-MB-231生物學特性的影響 目的:用攜帶有HSP27基因的真核表達載體pCDNA3.1-HSP27分別轉(zhuǎn)染低水平表達內(nèi)源性HSP27的人正常乳腺上皮細胞系HBL-100和

7、人乳腺癌細胞系MDA-MB-231，觀察和分析上調(diào)HSP27表達對兩種細胞的形態(tài)、增殖活性、DNA倍體的影響，比較MDA-MB-231細胞的粘附、侵襲和遷移能力在轉(zhuǎn)染前后的變化，探討HSP27對乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的促進作用及其機制。 方法:采用陽離子脂質(zhì)體法將攜帶有人HSP27基因CDS序列的真核表達載體pCDNA3.1-HSP27分別轉(zhuǎn)染入人乳腺上皮細胞系HBL-100和人乳腺癌細胞系MDA-MB-231內(nèi)，以空載體質(zhì)粒pCDN

8、A3.1/myc-His(+)A轉(zhuǎn)染的細胞和未接受轉(zhuǎn)染的細胞為對照，G418篩選陽性克??；采用RT-PCR和Western-blot技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染組、空載體組和未轉(zhuǎn)染組細胞中HSP27 mRNA和蛋白的表達。分別應用倒置相差顯微鏡、MTT法和流式細胞技術(shù)，觀察和檢測轉(zhuǎn)染前后細胞大體形態(tài)的變化、細胞增殖活性的改變、細胞周期及DNA倍體的變化；RT-PCR法檢測cyclinD1、D21<'CIPl/WAFl>和p27<'KIPl>的表達。同時

9、采用MTT法檢測轉(zhuǎn)染、空載體和未轉(zhuǎn)染三組MDA-MB-231細胞與細胞外基質(zhì)的粘附能力，Trariswell小室法檢測其侵襲和轉(zhuǎn)移能力，流式細胞術(shù)分析CD44v6，MMP-9和TIMP-1的表達。 結(jié)論:穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-HSP27質(zhì)粒的HBL-100和MDA-MB-231細胞內(nèi)HSP27的mRNA和蛋白表達水平均明顯升高。HSP27能降低HBL-100中p27<'KIPl>的表達，從而促進細胞增殖并提高其S期細胞比例，

10、同時能夠提高細胞DNA含量，這可能是HSP27促進正常乳腺上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化的機制；HSP27能夠降低MDA-MB-231細胞的遷移能力，但它同時能夠提高細胞DNA含量，并通過促進細胞中CD44v6和MMP9的表達，降低TIMPl的水平，提高細胞的異質(zhì)型粘附和侵襲能力，這可能是HSP27促進乳腺癌發(fā)展的分子機制。 第四部分：熱休克蛋白27對乳腺癌細胞化療敏感性影響的實驗研究 目的:高表達HSP27的乳腺癌細胞能對包括阿霉素

11、在內(nèi)的一些化療藥物產(chǎn)生耐藥，目前尚無HSP27是否影響紫杉醇抗癌作用的研究，并且據(jù)報道紫杉醇能夠抑制子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌細胞中HSP27的表達。本實驗旨在研究HSP27高表達能否誘導乳腺癌細胞對紫杉醇產(chǎn)生耐藥，紫杉醇能否抑制乳腺癌細胞中HSP27的表達，確定更有效的紫杉醇聯(lián)合阿霉素的使用方法。 方法:以內(nèi)源性高表達HSP27的人乳腺癌細胞系MDA-MB-435、MCF-7和內(nèi)源性低表達HSP27的人乳腺癌細胞系MDA-MB-231

12、為研究對象。采用MTT技術(shù)檢測分析阿霉素、紫杉醇、阿霉素一紫杉醇序貫和紫杉醇一阿霉素序貫治療對具有不同HSP27表達水平的乳腺癌細胞的腫瘤抑制作用，流式細胞術(shù)分析藥物處理后腫瘤細胞的凋亡情況；并應用Western-blot方法分析化療藥物處理前后細胞中HSP27、TopoⅡα、Topo Ⅱβ表達的變化情況。 結(jié)論:HSP27不能誘導乳腺癌細胞對紫杉醇產(chǎn)生耐藥；紫杉醇能夠抑制乳腺癌細胞中HSP27的表達，并提高Topo Ⅱ的表達；