銅綠假單胞菌噬菌體PaP3多糖解聚酶基因PSD的克隆表達及活性鑒定的研究.pdf

1、細菌生物膜是指被自身產生的外部多糖基質，纖維蛋白，脂蛋白等包裹著的菌細胞的結構群體，作為一種普遍存在的自然現象，它在細菌的黏附，定植和抗吞噬方面發(fā)揮著重要的作用。它賦予細菌對各種因素的抵抗力也是許多持續(xù)性和慢性細菌感染的根源。據統(tǒng)計，80％以上的感染性疾病是由被膜菌引發(fā)的。在醫(yī)學上，被膜菌類感染也是慢性頑固性細菌感染的重要原因。由于生物膜內的細菌幾乎對所有的抗菌藥物都不敏感，表現極強的耐藥性，所以嚴重威脅著人類的生命健康。因此，如果能夠

2、尋找到新的破壞細菌生物膜的措施，無疑對阻斷細菌的致病作用以及提高其對藥物的敏感性進而殺滅耐藥菌都有著重要的意義。此外，有效的控制細菌生物膜，在工業(yè)、航海業(yè)和水產養(yǎng)殖業(yè)等領域也具有廣闊的應用前景。 噬菌體，作為細菌的病毒，能夠特異性的感染和裂解細菌。早在上個世紀二十年代，人們首次引入噬菌體來治療細菌的感染并取得了良好的效果。但隨著抗生素時代的來臨，這種治療方法的發(fā)展受到了限制。近年來各種耐藥性菌株的大量出現，使人們再一次把目光集中

3、到了噬菌體上。噬菌體療法，顧名思義，就是運用噬菌體及其產物來治療和預防各種細菌性的感染疾病。盡管噬菌體在90年前就已經被成功的分離，但由于抗生素療法的大量推廣，所以噬菌體在臨床上一直沒有得到廣泛的運用。直到最近，大量耐藥性菌株的出現，使得人們不得不尋找一種對付細菌的新方法，運用噬菌體，這種細菌的病毒來治療細菌性疾病，再一次引起了人們的極大關注。從人類發(fā)現噬菌體以來，各種途徑運用噬菌體進行的醫(yī)療活動已經在很多的國家中展開，并且一直沒有噬菌

4、體治療引發(fā)相關嚴重并發(fā)癥的報道。因此，噬菌體及其相關產物在臨床治療方面的運用具有廣闊的前景。噬菌體要想進入細菌內部裂解菌體細胞，首先必須突破被膜菌表面的糖被，即胞外多糖被(：Exopolysaccharide，EPS)。已有研究表明噬菌體的確能夠產生多糖解聚酶(polysaccharidedepolymerase，PSD)特異性的降解胞外多糖成分，盡管這種“酶學消毒法”只是消解了生物膜，脫掉了被膜菌表面的保護層，但這已經大大消除了被膜菌

5、黏附、定植、抗吞噬的致病性以及對抗生素的耐受性，從而極大的方便了臨床上對于被膜菌感染的治療。 本室在國家自然科學基金(30070037)的資助下，已經完成對銅綠假單胞菌噬菌體PaP3的全基因組測序，基因組序列和注釋已經登錄GenBankfNC004466)。我們在PaP3基因組中發(fā)現PaP3p02基因的編碼產物被推定為多糖解聚酶家簇的成員。這種多糖解聚酶基因產物具有降解細菌胞外多糖的作用，使之有可能成為專門破壞細菌生物膜的“酶學

6、消毒劑”。 基于此，本文首先克隆了多糖解聚酶全長基因，并成功構建了多糖解聚酶重組質粒，隨后經表達、純化獲得多糖解聚酶融合蛋白。最后，通過對多糖解聚酶的體外抑菌活性的鑒定來探討其作為細菌生物膜酶學降解制劑的應用前景。其研究內容和結果主要包括以下幾個方面： 1.銅綠假單胞菌噬菌體PaP3多糖解聚酶全長基因的擴增：通過對PCR反應體系與條件的優(yōu)化，擴增到了多糖解聚酶全長結構基因，為制備多糖解聚酶融合蛋白奠定了基礎。 2

7、.銅綠假單胞菌噬菌體PaP3多糖解聚酶全長基因的克?。簩⒍嗵墙饩勖溉L基因插入原核表達載體pQE-31，成功構建了多糖解聚酶重組質粒Pqe-PSD。該重組質粒經位于多糖解聚酶目的片段5'端的BamHI和3'端HindⅢ雙酶切鑒定后，對重組質粒進行核苷酸測序，結果表明，重組質粒的序列和閱讀框均正確。 3.銅綠假單胞軍菌噬菌體PaP3多糖解聚酶全長基因的表達與純化：將多糖解聚酶重組質粒轉化大腸埃希菌JM109，獲得了表達穩(wěn)定的多糖解

8、聚酶基因工程菌。在制備融合蛋白包涵體的過程中，發(fā)現目的蛋白主要以分泌型表達為主，80％的融合蛋白存在于上清中。在上清中目的蛋白的表達量是包涵體表達量的4倍以上。故對融合蛋白上清行非變性的Ni-NTA柱親和層析以及目的蛋白的分子篩層析純化后，能夠獲得單一條帶的目的蛋白，基本無雜蛋白的存在，蛋白純度在95％以上。說明采用非變性親和層析可以實現多糖解聚酶融合蛋白的一步純化。BCA法測定目標蛋白濃度為2.278mg/ml。 4.多糖解聚

9、酶融合蛋白的活性測定：提取銅綠假單胞菌生物膜多糖成分，用挖孔法測定多糖解聚酶對生物膜多糖的降解活性。結果顯示，加入重組噬菌體PaP3多糖解聚酶基因蛋白孔中，形成了直徑約為1.5cm的透明圓環(huán)，而加入PBS(陰性對照)的孔中，無透明抑菌環(huán)的形成。初步說明多糖解聚酶基因蛋白對生物膜的胞外多糖具有一定的降解活性。 5.多糖解聚酶融合蛋白體外抑菌活性研究：采用微量倍比稀釋法測定多糖解聚酶作用前后銅綠假單胞菌PA3對四種敏感抗生素(慶大霉

10、素、環(huán)丙沙星、加替沙星、頭孢他啶)MIC，MBC的變化，對比結果發(fā)現，多糖解聚酶作用后四種抗生素的相應的MIC、MBC都出現了不同程度的降低，其中以頭孢他啶降低最為明顯。提示多糖解聚酶與抗生素的協(xié)同作用具有一定的抗菌活性。采用FITC-ConA/PI熒光雙染銅綠假單胞菌PA3生物膜，與通過多糖解聚酶融合蛋白處理的PA3生物膜對照，結果顯示多糖解聚酶的處理可降解細菌生物膜胞外多糖結構，視野中可見染成綠色的多糖組分小而分散，包裹在胞外多糖組

11、分里的細菌數量也大大減少。充分說明多糖解聚酶確實能夠特異性的降解生物膜的胞外多糖組分并兼有一定的殺菌活性。 綜上所述，本研究通過對PCR反應體系的優(yōu)化，擴增到了多糖解聚酶全長結構基因，為制備多糖解聚酶融合蛋白奠定了基礎；同時，通過對多糖解聚酶的表達和純化，拿到了具有活性的重組多糖解聚酶融合蛋白。獲得的融合蛋白經體外活性檢測證實，對銅綠假單胞菌生物膜胞外多糖成分具有一定的降解活性，為進一步研究其以后在臨床上各種抗感染治療的運用奠定