microRNA在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中表達差異譜的研究.pdf

1、目的：觀察鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病(DM)大鼠早期視網(wǎng)膜的形態(tài)學改變，評價其作為早期糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)動物模型的應用價值；測定DM大鼠視網(wǎng)膜VEGFmRNA和PEDF mRNA于不同時間點的表達情況，探討二者間的相互關系及其對于DR發(fā)生發(fā)展的相關意義，并從細胞因子角度進一步評價STZ-DM大鼠作為早期DR動物模型的應用價值。以10w STZ-DM大鼠作為早期DR動物模型，檢測視網(wǎng)膜microRNAs(miRNAs)的表達差

2、異譜，并初步探討其在DR發(fā)生發(fā)展過程中的作用。
　　 方法：64只體重180±20g雄性SD大鼠隨機分為CON組和DM組各32只，DM組按60mg/kg體質量腹腔注射STZ1次建立DM大鼠模型；CON組腹腔注射等量檸檬酸緩沖液作為對照。DM成膜后每周測量各組體質量、血糖等一般生理指標，并于2w、4w、6w、8w和10w各時間點隨機抽樣行視網(wǎng)膜實時定量PCR(qRT-PCR)檢測視網(wǎng)膜VEGFmRNA、PEDF mRNA的表達豐度

3、。10w時各組隨機抽樣對視網(wǎng)膜組織進行HE染色、FITC-Dextran灌注視網(wǎng)膜血管鋪片及透射電鏡超微結構觀察；免疫組化染色檢測視網(wǎng)膜VEGF及PEDF的表達強度及部位；miRNA基因芯片篩選DM組與CON組視網(wǎng)膜表達顯著差異的miRNAs。qRT-PCR檢測目的miRNAs于每個時間點在視網(wǎng)膜中的表達豐度。并通過生物信息學分析預測表達差異顯著miRNAs的可能靶基因。
　　 結果：
　　 1.STZ腹腔注射DM成模率

4、100％。注射前DM組平均體質量(187.5±5.4g)與CON組(185.0±6.9g)差異不顯著(P＞0.05)；STZ腹腔注射后，DM組體質量增加不明顯，后期甚至有所減輕，CON組體質量逐步增長，10w時DM組平均體質量(169.9±26.9g)與CON組(439.2±23.5g)差異顯著(P＜0.001)。注射前DM組平均血糖(6.49±0.68mmol/l)與CON組(6.60±0.59mmol/L)差異不顯著(P＞0.05)

5、；STZ腹腔注射72h后，DM組平均血糖(26.63±4.54mmol/l)與CON組(6.37±0.49mmol/l)差異顯著(P＜0.001)，～10wDM組血糖均＞16.7mmol/l，CON組保持在5.6～7.4mmol/l。視網(wǎng)膜HE染色顯示10w DM組大鼠視網(wǎng)膜毛細血管擴張，間質水腫；CON組視網(wǎng)膜未見明顯異常。FITC-Dextran灌注視網(wǎng)膜顯示10w DM組血管迂曲，管徑不規(guī)則，未見毛細血管熒光滲漏、微血管瘤、視網(wǎng)膜

6、無灌注區(qū)等；CON組血管管徑均勻一致、分支自然流暢。透射電鏡下DM組視網(wǎng)膜超微結構的改變主要有：毛細血管基底膜增厚，內皮細胞指狀突起，線粒體腫脹、嵴脫落、空泡樣變；周細胞線粒體腫脹、嵴脫落、空泡樣變；內核層雙極細胞線粒體腫脹、嵴脫落、空泡樣變；感光細胞膜盤間隙增寬、數(shù)量減少；神經(jīng)節(jié)細胞線粒體腫脹、嵴脫落、空泡樣變。
　　 2.經(jīng)qRT-PCR檢測，CON組視網(wǎng)膜有VEGF mRNA表達，表達量隨時間無明顯變化；DM組VEGF m

7、RNA的表達，2w時較CON組有所增高，至6w表達量約為CON組的3倍(P＜0.05)，10w表達量增高到CON組的6倍(P＜0.001)。PEDF mRNA也表達于CON組視網(wǎng)膜，DM組2w時的表達量較CON組有所減少，至4w其表達量約為CON組的1/2(P＜0.001)，10w表達量降至CON組的1/3(P＜0.001)。視網(wǎng)膜免疫組化染色觀察，CON組：VEGF主要分布于內核層和節(jié)細胞層，PEDF主要分布于內核層和節(jié)細胞層，其余各

8、層也可見陽性表達；DM組VEGF表達較CON組明顯增強，視網(wǎng)膜各層神經(jīng)細胞均見有強陽性表達；PEDF表達較CON組明顯減弱，其分布主要位于節(jié)細胞層及內叢狀層。
　　 3.miRNA芯片檢測結果顯示：和CON組比較，DM組共有168個miRNAs的表達出現(xiàn)明顯變化。其中，主要有miR-182、miR-96、miR-183、miR-211、miR-204、miR-124、miR-592、miR-190b、miR-502-3p、miR

9、-363、miR-29c*、miR-210等表達顯著上調；miR-10b、miR-10a、miR-219-2-3p、miR-144、miR-338、miR-199a、miR-451、miR-34a、miR-542-5p、miR-142-3p、miR-223、miR-18a等表達顯著下調。經(jīng)qRT-PCR檢測，大部分表達上調的miRNAs在視網(wǎng)膜中的表達量隨病程發(fā)展逐漸上升；表達下調的12個miRNAs的表達量隨病程發(fā)展均逐漸下降。生物信

10、息學分析結果顯示，這些表達顯著差異的miRNAs可以調控許多與DR密切相關基因的表達，如miR-29c*、miR-199a可能靶向VEGFa，miR-363可能靶向PEDF，等等。
　　 結論：
　　 1.STZ誘導的DM大鼠在病程10w時即已出現(xiàn)類似早期DR的相關改變，可作為人類早期背景型糖尿病視網(wǎng)膜病變(background diabetic retinopathy,BDR)的動物模型以用于DR的相關實驗研究，并且該

11、造模方法簡單經(jīng)濟、用時較短、重復性好、成功率高。
　　 2.作為主要血管生成刺激因子的VEGF和潛在血管生成抑制因子的PEDF，二者間的動態(tài)平衡對調節(jié)血管滲漏與新生血管形成起著至關重要的作用。生理狀態(tài)下，VEGF在視網(wǎng)膜中呈低表達，而PEDF相對占有優(yōu)勢，這對維持視網(wǎng)膜血管完整、抑制新生血管形成是非常必要的。10w DM大鼠視網(wǎng)膜VEGF表達增多、PEDF減少，破環(huán)了二者間的平衡關系，繼而可能導致視網(wǎng)膜出現(xiàn)血管滲漏和新生血管等。

12、這就說明VEGF與PEDF的失衡可能是造成DR發(fā)生發(fā)展的重要因素之一，同時也從細胞因子角度進一步證明了10w STZ-DM大鼠可作為早期BDR的動物模型。
　　 3.早期BDR大鼠模型視網(wǎng)膜中，miRNAs的表達譜較正常對照有明顯差異；在這些表達明顯差異的miRNAs中，有些隨病程發(fā)展表達量逐漸上升，還有些隨病程發(fā)展逐漸下降；這些表達差異的miRNAs可能靶向許多與DR發(fā)生發(fā)展密切相關的基因。提示：miRNAs在DR發(fā)生發(fā)展過程