葡萄細胞的懸浮培養(yǎng)及誘導子對懸浮細胞多酚產量影響的研究.pdf

1、利用懸浮培養(yǎng)提高植物次生代謝物的產量，是生產某些次生代謝物的新方法。本實驗利用鮮食葡萄巨峰，釀酒葡萄赤霞珠、黑比諾作為材料，以B5培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基通過調整培養(yǎng)基的配比和激素濃度建立起了穩(wěn)定的細胞懸浮體系，優(yōu)化了細胞懸浮培養(yǎng)條件。通過在細胞懸浮培養(yǎng)過程中的不同時期添加不同濃度的外源誘導物質，蔗糖、苯丙氨酸。茉莉酸甲酯和紫外光(UV-C)處理，研究了誘導子對巨峰葡萄懸浮細胞生長和總酚、花青素、白藜蘆醇產量的影響。為利用細胞培養(yǎng)進行次生代

2、謝物的大規(guī)模工業(yè)化生產提供了理論依據。 本實驗研究結果如下： 1.建立了穩(wěn)定的葡萄細胞懸浮體系選擇了適合葡萄愈傷組織產生和進行懸浮培養(yǎng)的激素濃度及配比、pH、蔗糖濃度等。不同的葡萄品種誘導愈傷組織和懸浮培養(yǎng)所需要的激素濃度與組合是不同的。以B5+250mg·L-1水解酪蛋白+0.1mg·L-1NAA+0.2mg·L-1KT+30g·L-1蔗糖+6g·L-1瓊脂為誘導愈傷組織的培養(yǎng)基，三種材料均能建立起適合愈傷組織生長的培

3、養(yǎng)體系。以B5+1.0mg·L-1NAA+0.5 mg·L-16-BA+30g-L-1蔗糖組成的液體培養(yǎng)基能建立起適合巨峰生長的細胞懸浮體系。以B5+250 mg·L-1水解酪蛋白+2.0mg·L-12,4-D+0.2 mg·L-1KT+1％PVP+30g·L-1蔗糖組成的培養(yǎng)基能建立起適合赤霞珠生長的懸浮細胞系。以B5+1.0 mg·L-1NAA+0.5mg·L-1 6-BA+0.2％PVP+30g·L-1蔗糖組成的培養(yǎng)基能建立起適合

4、黑比諾生長的懸浮細胞系。從生長狀況來看，三種材料的愈傷組織和懸浮細胞生活力均為巨峰>赤霞珠>黑比諾。巨蜂葡萄的懸浮細胞呈粘稠、均一、穩(wěn)定的黃白色，以單個細胞和小細胞團的形式存在，適合進行誘導處理；釀酒葡萄赤霞珠和黑比諾的懸浮細胞主要以單個細胞和小細胞團的形式存在，底部存在有少量的的組織團塊，顏色較深，易褐化。 2.選擇了適合懸浮培養(yǎng)的繼代方法選取連續(xù)繼代數次(3次以上)的新鮮、松軟易碎的黃白色愈傷組織15.20g，放入裝有40m

5、l液體培養(yǎng)基的100ml三角瓶中，25℃下120rpm，黑暗條件下搖床上振蕩培養(yǎng)，24h后將葡萄細胞懸浮液靜置，將上層培養(yǎng)基連同單細胞和小細胞團一起轉移到滅過菌的空三角瓶中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，棄去大的組織團塊及大的細胞團。3-4d后視情況用同樣的方法再轉移一次。一周后將已經粘稠的、正處于對數生長期的細胞加入其體積一半的液體培養(yǎng)基稀釋，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)。達到一定體積后轉移到大的三角瓶中，用同樣的方法繼續(xù)添加培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)。直到達到一定數量的均一穩(wěn)定

6、的細胞懸浮培養(yǎng)液。在以后的繼代過程接種量每40mL只要5～10g之間就可以快速建立起生長穩(wěn)定的細胞懸浮培養(yǎng)體系． 3.探索了防止和減輕懸浮細胞褐化的方法通過對愈傷組織的挑選、接種量的控制、轉瓶、PVP和大孔吸附樹脂的利用以及挽救等措施，探索了防止和減輕懸浮細胞褐化的方法。 4.誘導處理對細胞生長的影響各種誘導處理對懸浮細胞生物量的增加都沒有促進作用，相反誘導處理之后懸浮細胞會出現或輕或重的褐化現象。 5.蔗糖對巨

7、峰懸浮細胞多酚合成的影響不同濃度的蔗糖對懸浮細胞總酚的含量都有提高作用，并且總酚含量隨著蔗糖濃度的增加而增加，但是蔗糖濃度越高褐化越嚴重。而蔗糖的添加對花青素的含量影響不大，30g·L-1的蔗糖能輕微提高花青素含量，7.5g·L-1和15g·L-1的蔗糖對花青素的含量則有輕微抑制作用。對于白藜蘆醇，適當濃度的蔗糖對其含量有提高作用，濃度過高則有抑制作用。15g·L-1的蔗糖能顯著提高白藜蘆醇的含量。 6.苯丙氨酸對巨峰懸浮細胞多

8、酚合成的影響苯丙氨酸的添加能顯著提高總酚、花青素和白藜蘆醇的含量。 7.茉莉酸甲酯的添加對總酚和白藜蘆醇的含量都有促進作用，但對花青素的含量有輕微的抑制作用。 8.紫外光處理對巨峰懸浮細胞多酚合成的影響一定強度的紫外光UV-C處理能提高懸浮細胞的多酚含量。在紫外燈(直徑D=2.5cm，長度L=88 cm，功率P=30W，λ=254nm)放在距懸浮細胞35cm處照射強度為41.5μW·cm-2也條件下照射2h，總酚、花青素