誘導子調控紅松細胞合成松多酚機制的研究.pdf

1、多酚是紅松中具有重要生理功能的次生代謝產物，可以提高機體抗氧化能力，有助于預防癌癥和心腦血管疾病的發(fā)生，在營養(yǎng)、健康、醫(yī)藥領域的關注度逐漸提高。因此研究紅松多酚合成代謝途徑及其調控手段具有重要的意義。本研究以組織培養(yǎng)紅松胚誘導生成的不定芽為實驗材料，以8種誘導子(PHE、CA、MeJA、SA、CTS、YE、La、Eu)為研究對象，以多酚和原花青素含量為指標，進行誘導子的篩選工作，確立促進紅松多酚合成最佳的誘導子以及最佳的誘導處理組合條件

2、，進一步分析誘導子對紅松氧化應激防御系統(tǒng)的影響;采用Illumina HiSeq技術對紅松進行轉錄組測序，挖掘與多酚生物合成相關功能基因，分析紅松多酚的合成代謝途徑;采用RT-PCR技術分析誘導子對紅松多酚合成相關功能基因的表達影響，探究誘導子調控多酚合成的作用機制。主要的研究結果如下：
　　在供試濃度范圍內，不同的誘導子對紅松不定芽的生長具有不同的生理作用，PHE、CTS、YE、La和Eu在合適的濃度范圍內可以顯著促進生長;CA

3、、MeJA和SA明顯抑制生長;高濃度的PHE、CTS也會抑制生長。7種誘導子(PHE、MeJA、SA、CTS、YE、La、Eu)在合適的濃度范圍內可以顯著提高多酚和原花青素的積累量，促進多酚物質的合成，最佳的誘導濃度分別為2mmol/L PHE、10μmol/L MeJA、40μmol/LSA、100 mg/L CTS、100mg/L YE、100μmol/L La和400μmol/L Eu。
　　Plackett-Burman實

4、驗結果顯示，7種誘導子因素影響多酚積累量的顯著性大小依次為:CTS＞La＞MeJA＞PHE＞Eu＞SA＞YE，確定影響多酚積累量的3種關鍵因素為:CTS、La、MeJA。通過對CTS+La+MeJA組合誘導條件進行Box-Benhnken Design響應面優(yōu)化實驗，優(yōu)化得到的最佳誘導條件為:CTS79.58mg/L、La42.21μmol/L、MeJA16.63μmol/L，預測多酚積累量最高可達到14.28mg/g FW，實際多酚積

5、累量為13.42 mg/gFW，與對照組相比提高了122.19％。3種誘導子CTS、La、MeJA促進多酚合成具有協同增效作用。
　　3種誘導子MeJA、CTS、La以及CTS+ La+MeJA組合可以顯著激活紅松抗氧化防御反應和苯丙烷代謝途徑，促進多酚物質合成與積累，誘導響應時間和強度具有差異性。CTS+ La+MeJA組合誘導效果顯著優(yōu)于3種誘導子單獨使用，利用3種誘導子之間的協同作用，可以緩解MeJA對紅松不定芽生長的抑制作

6、用;更大程度提高紅松氧化應激防御系統(tǒng)抗氧化酶(SOD、POD、CAT、PAL、C4H)的活性和增加抗氧化物質（多酚、原花青素）的積累量。CTS+ La+MeJA作為外源誘導子通過信號轉導系統(tǒng)將誘導信號傳遞到細胞內，迅速刺激紅松不定芽的氧化應激防御系統(tǒng)，苯丙烷代謝途徑被活化，促進了抗氧化物質多酚的合成與積累。
　　通過Illumina HiSeq技術對紅松不定芽進行了轉錄組測序分析，獲得了13369359條contig，172608

7、條unigene。將獲得的unigene與NR、GO、KOG和KEGG基因數據庫進行比對和功能預測。其中58406(33.84％)條unigenes得到了功能注釋;17996條μnigene歸納到GO數據庫的48個聚類中;26026條unigene被注釋到KOG數據庫的25個功能類別;9846條unigene歸入KEGG數據庫的334條生物學通路中;997條unigene參與了次生代謝生物合成。通過功能注釋發(fā)現有49條unigene參與

8、了紅松多酚的生物合成，涉及了5條次生代謝生物合成途徑（苯丙烷生物合成途徑、類黃酮生物合成途徑、黃酮和黃酮醇生物合成途徑、花青素生物合成途徑、二苯乙烯生物合成途徑）和14個相關功能基因(PAL、C4H、4CL、CHS、F3H、F3'H、FLS、DFR、ANR、LAR、UFGT、3-OMT、CCoAOMT、HCT)。
　　CTS+La+MeJA處理組和對照組兩個紅松轉錄樣本進行差異表達分析，篩選出5713條差異表達unigene，其中

9、3449條unigene為表達上調，2264條unigene為表達下調，主要參與核糖體途徑、生化代謝途徑和次生代謝物的生物合成途徑。在差異表達文庫中篩選出與多酚合成相關的23條表達上調unigene編碼多酚合成途徑中8個功能基因
　　（PAL、4CL、CHS、F3H、DFR、ANR、LAR和UFGT）。將這8個功能基因進行RT-PCR驗證和表達分析，誘導子(CTS、MeJA、La、CTS+La+MeJA)均可誘導8種功能基因顯著表

10、達，其中轉錄水平變化最大的為CHS，其次為ANR和LAR。初步證實CHS、ANR、LAR為紅松多酚合成的關鍵功能基因。CTS+La+MeJA組合誘導紅松細胞CHS、ANR、LAR的上調表達最為顯著，分別是對照組的185、25、21倍。CTS+La+MeJA誘導提高總酚和總原花青素含量的同時，還可以顯著提高兒茶素、表兒茶素、原花青定B2和花旗松素4種單體酚的含量。CTS+La+MeJA誘導多酚合成關鍵酶基因CHS、ANR、LAR的高表達與