DHAV-3 LS株遺傳變異分析、VP1蛋白表達(dá)及熒光定量PCR分型方法的建立.pdf

1、鴨病毒性肝炎(DVH)是由鴨肝炎病毒(DHV)感染3周齡以內(nèi)雛鴨引發(fā)的一種急性、高致死性的病毒性傳染病，嚴(yán)重影響?zhàn)B鴨業(yè)的發(fā)展。目前我國流行的DVH病原主要是鴨甲型肝炎病毒(duck hepatitis A virus，DHAV)。因此，開展DHAV的病毒分離、遺傳進(jìn)化、主要結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)及病原鑒別診斷方法的研究對今后DHAV分子流行病學(xué)研究、病原檢測與疾病防控具有重要意義。
　　本研究采集山東省梁山縣某鴨場發(fā)生的1起疑似DVH病例的

2、臨床病料，通過鴨胚增殖、動物回歸試驗(yàn)、ELD50測定和RT-PCR方法分離鑒定，得到一株DHAV-3毒株，命名為LS株。對分離毒株的全基因組進(jìn)行了RT-PCR擴(kuò)增、基因克隆、序列測定與分析，結(jié)果表明，LS株整個基因組全長7815nt，不含帽子結(jié)構(gòu)，其中5'非編碼區(qū)(5'UTR)長652nt，整個ORF長6756nt，3'端非編碼區(qū)(3'UTR)長366nt，后面帶有至少26個A的poly(A)尾巴。LS株與DHAV-3參考株核苷酸、氨基

3、酸同源性最高，達(dá)97.4％和99.0％;與C-BLZ株、SD1201株親緣關(guān)系最近，處于同一較小的分枝上。因此證明LS株屬于DHAV-3。
　　利用相關(guān)分子生物學(xué)技術(shù)對LS株VP1結(jié)構(gòu)蛋白的氨基酸序列和主要抗原表位進(jìn)行比對分析，并針對高變區(qū)使用原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，B細(xì)胞抗原表位存在第132-139、178-191、195-203、211-221位氨基酸區(qū)段的可能性最大，同時這些位點(diǎn)也是最易變異的位點(diǎn)。針對高變區(qū)選取

4、的第132-240位氨基酸區(qū)段得到成功表達(dá)，純化的融合蛋白分子量約為38ku。Western blot分析結(jié)果表明，融合蛋白能被抗GST標(biāo)簽鼠單克隆抗體特異性識別，證明該蛋白具有良好的反應(yīng)原性。
　　本研究還針對1、3型鴨甲肝病毒5端保守區(qū)設(shè)計一對特異性引物，采用SYBR GreenⅠ熒光染料，成功建立了一種基于熒光定量PCR熔解曲線法的DHAV分型檢測方法。結(jié)果表明，建立的方法特異、快速、敏感，對1.0×102～1.0×109

5、copies/μL濃度的模板均有較好的檢測效果，最低檢出量均為100 copies/μL，是普通PCR的100倍;特異性好，排除常見禽源病毒的干擾;對高、中、低不同濃度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品檢測表現(xiàn)出良好重復(fù)性。利用建立方法對DHAV-1和DHAV-3感染雛鴨后在體內(nèi)組織器官的增殖規(guī)律進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)鴨甲型肝炎病毒廣泛增殖于鴨的大部分組織臟器內(nèi)。兩種病毒在組織器官中的增殖規(guī)律大體一致，其中對肝臟最具有嗜性，脾臟、腎臟、肺臟中病毒滴度也很高，進(jìn)而從病毒