小鼠侵襲性肺曲霉病模型的構(gòu)建及TLR2、TLR4的表達(dá).pdf

1、[目的]
　　 對(duì)清潔級(jí)(Specific pathogen Free，SPF)BALB/c小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide CY)復(fù)制出免疫抑制(immunocompromised host，ICH)模型后，通過(guò)對(duì)比霧化吸入不同濃度的煙曲霉菌孢子懸液(aspergilosis fumigatus spore，Afs)來(lái)構(gòu)建侵襲性肺曲霉病(invasive pulmonary aspergillosis，I

2、PA)模型，檢測(cè)TLR2(Toll like receptor2，TLR2)、TLR4(Toll like receptor4，TLR4)的表達(dá)，探討其在IPA中的作用機(jī)制。
　　 [方法]
　　 75只SPF級(jí)6-8周齡雌性BALB/c小鼠，體重18-22克，隨機(jī)分成5組，分別為A空白對(duì)照組、B免疫抑制高濃度Afs模型組，C高濃度Afs正常感染組，D免疫抑制低濃度Afs模型組，E低濃度Afs正常感染組。根據(jù)羅[43]的

3、方法，首先對(duì)模型組注射CY復(fù)制ICH模型。Afs高濃度和Afs低濃度組，分別用霧化器霧化108cfu·ml-1、109cfu·ml-1兩種濃度的孢子懸液12ml，空白組以滅菌PBS代替孢子懸液。分別于感染后第1、3、5天眼球取血處死小鼠，并收集標(biāo)本。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)肺泡灌洗液(BALF)中干擾素-γ(IFN-γ)的含量；以熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)各組小鼠肺組織中的IFN-γmRNA的表達(dá)；肺組織

4、病理標(biāo)本行蘇木素-伊紅(HE)染色、糖原染色(PAS)染色觀察小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)改變；以RT-PCR檢測(cè)各組小鼠肺組織中TLR2mRNA、TLR4mRNA的表達(dá)，免疫組織化學(xué)(IH)法檢測(cè)各組小鼠肺組織中TLR2、TLR4蛋白的表達(dá)。
　　 [結(jié)果]
　　 1小鼠外周血淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)的變化對(duì)注射CY后的小鼠，取尾靜脈血后，用白細(xì)胞計(jì)數(shù)液(2％乙酸溶液)進(jìn)行淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)，與正常組對(duì)比，注射第2天的淋巴細(xì)胞數(shù)量降低顯著(P<

5、0.05)。
　　 2 ICH、IPA小鼠的反應(yīng)性觀察對(duì)小鼠腹腔注射200mg·kg-1CY，連續(xù)注射2天，體毛蓬松凌亂，缺少光澤。小鼠較萎靡，反應(yīng)遲鈍，活動(dòng)明顯減少。ICH小鼠經(jīng)高濃度Afs感染后表現(xiàn)為萎靡少動(dòng)，食欲差，呼吸急促，口周?chē)鲅獓?yán)重、煩躁不安和腹肌抽搐甚至死亡等癥狀，不同劑量組小鼠死亡率差異均有顯著性(P<0.05)。
　　 3 BALF中IFN-γ的含量測(cè)定及肺組織中IFN-γmRNA表達(dá)與A組對(duì)比，B組

6、BALF中的IFN-γ與肺組織中IFN-γmRNA含量在第5天的表達(dá)量降低顯著(P<0.05)。與A組對(duì)比，C組BALF中的IFN-γ與肺組織中IFN-γmRNA含量在第3天，第5天增加顯著(P<0.05)(P<0.05)。與A組對(duì)比，D組BALF中的IFN-γ與肺組織中IFN-γmRNA含量在第3天增加顯著(P<0.05)。與A組對(duì)比，E組BALF中的IFN-γ與肺組織中IFN-γmRNA含量在第1天有顯著的增加(P<0.05)4肺組

7、織病理改變第3天時(shí)，B組小鼠肺組織可見(jiàn)肺膿腫，可見(jiàn)到孢子；第5天時(shí)肺內(nèi)有孢子聚積，可見(jiàn)到菌絲，以及較嚴(yán)重的出血和充血，肺泡間隔增寬，氣管上皮細(xì)胞脫落壞死。C組小鼠肺組織可見(jiàn)充血，肺泡彈性纖維被破壞，炎癥和出血，未見(jiàn)有孢子菌絲。
　　 5 IH檢測(cè)肺組織TLR2、TLR4蛋白的表達(dá)B組TLR2呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；A組為陰性表達(dá)，與A對(duì)比，B組著色的氣管上皮細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率顯著增加；C組TLR2陽(yáng)性表達(dá)率低于B組；B、C組TLR4均呈陽(yáng)性表

8、達(dá)，C組陽(yáng)性表達(dá)率高于B組。
　　 6小鼠肺組織TLR2mRNA、TLR4mRNA含量的表達(dá)與A組對(duì)比，B組肺組織中TLR2mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.05)：TLR2的表達(dá)量隨著感染時(shí)間的增加而增加；C組TLR2mRNA第1天表達(dá)增加，第3天增加顯著(P<0.05)，第5天表達(dá)量降低，沒(méi)有顯著差異(P>0.05)；與A組對(duì)比，B組、C組TLR4mRNA表達(dá)量均增加(P<0.05)(P<0.05)，C組TLR4mRNA的表達(dá)量

9、高于B組(P<0.05)。
　　 [結(jié)論]
　　 1對(duì)ICH小鼠霧化Afs能成功誘導(dǎo)BALB/C小鼠IPA模型，Afs高濃度(109cfu·ml-1)能建立具有典型病理特征的穩(wěn)定的IPA模型；
　　 2 IPA模型組在第3天就能出現(xiàn)肺部炎癥的表現(xiàn)，并有孢子生成，在第5天時(shí)炎癥反應(yīng)更嚴(yán)重，出現(xiàn)肺膿腫，肺出血、充血，并能見(jiàn)到菌絲。
　　 3在成功建立肺曲霉菌病模型的基礎(chǔ)上，檢測(cè)TLR2和TLR4的表達(dá)。空白對(duì)