MDIG對細胞周期的調控機制及其在肺癌中的作用的研究.pdf

1、背景與目的：
　　肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，也是最主要的癌癥致死病因。2012年，美國預期肺癌新增病例226，160例，占全部預期癌癥新增病例的13.8％;預期肺癌死亡病例160，340例，占全部預期癌癥死亡病例的27.78％。目前肺癌的發(fā)病機制尚不完全清楚。
　　MDIG(Mineral dust-induced gene)，即礦物粉塵誘導基因，2005年首先在礦工的肺泡巨噬細胞中被發(fā)現，并被證實是一種肺癌相關基因。隨后

2、的研究表明，該基因與Tsuneoka等人發(fā)現的MINA53(Myc-induced nuclear antigen with amolecular mass of53kDa)是同源基因。MDIG在肺癌細胞株及肺癌組織中表達，具有促進細胞增殖的作用，且在部分肺癌患者中其表達水平高于癌旁正常肺組織。隨后，向人肺腺癌細胞株A549中轉染靶向MDIG小干擾RNA（mdig siRNA）后發(fā)現:細胞由DNA合成前期（G1期）向DNA合成期（S期）

3、的轉換延遲，說明MDIG對細胞周期有調節(jié)作用。
　　由G1期向S期轉換是細胞周期進程中的一個關鍵調控點。p27KIP1是一種CKI，在細胞周期中通過抑制cyclin D和CDK4/6形成的復合物及cyclin E和CDK2形成的復合物而抑制細胞由G1期向S轉換，是調控細胞周期進程的重要因子。
　　細胞周期調控失常導致細胞增殖失控，可能是腫瘤發(fā)生的重要機制之一。研究表明，在肺癌中，許多調控G1/S期轉換的基因異常表達。向鼠胚胎

4、成纖維細胞株NIH/3T3中穩(wěn)定轉染MDIG質粒后，通過基因芯片比較轉染MDIG質粒細胞株及對照質粒細胞株的cDNA的差異，發(fā)現:細胞周期基因在兩組細胞中有表達差異。然而，MDIG是如何調節(jié)細胞周期基因，二者的相互作用在肺癌發(fā)病機制中的意義尚不清楚。
　　我們推測，MDIG可能通過影響細胞周期基因參與肺癌的發(fā)生發(fā)展。因此，本文將A549細胞株作為靶細胞株來研究MDIG基因對細胞周期及細胞周期基因的影響，以期望闡述MDIG基因調控G

5、1/S期轉換的機制;在此基礎上，在手術切除的肺癌組織及癌旁正常肺組織中研究MDIG與細胞周期基因表達，以探討二者在肺癌發(fā)病機制中的臨床意義。
　　材料與方法：
　　1、細胞培養(yǎng)
　　人肺腺癌細胞株A549細胞用含10％熱滅活新鮮胎牛血清的RPMI1640的培養(yǎng)基，在37℃、5％CO2的條件下培養(yǎng)。
　　2、標本來源
　　收集自2009年4月至2009年12月在中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院胸外科行手術治療的原發(fā)性

6、肺癌患者的肺癌組織和癌旁正常肺組織標本共25對。全部患者在手術前未接受放射治療及化學藥物治療;在手術后經病理檢查證實為肺癌，其中:鱗癌10例、腺癌9例、小細胞癌4例及腺鱗癌2例;保存有完整的病例及預后資料。肺癌標本取自腫瘤中心且無壞死的部位，并經病理證實為癌組織;癌旁正常肺組織取自距離腫瘤可視邊界5cm以上的經病理證實為非炎癥、非淤血、非氣腫的正常肺組織。組織標本在離體后5分鐘內取材、置于液氮中5分鐘后，置于-80℃保存，進行蛋白質免疫

7、印跡(WB)分析;同時取部分肺癌組織經4％多聚甲醛固定，進行免疫組織化學染色(IHC)分析，以確定MDIG及p27KIP1的細胞內定位。
　　3、siRNA干擾
　　設計并合成靶向MDIG基因的siRNA（mdig siRNA）及陰性對照siRNA（scramble siRNA）。共分為5組，分別為:空白組、只加轉染試劑組（mock組）、陰性對照siRNA組（scramble siRNA組）、mdig siRNA1組及mdi

8、g siRNA2組。采用Lipofectamine2000將siRNA轉染至A549細胞中，在轉染后48小時及72小時，分別使用逆轉錄實時定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）和WB檢測干擾效率。
　　4、逆轉錄實時定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)
　　采用TRIZOL法提取細胞總RNA，NanoDrop1000分光光度計檢測RNA濃度，通過OD260/280比值判定RNA質量。采用PrimeScript(@)RT reage

9、nt Kit With gDNAEraser(Perfect Real Time)試劑盒進行逆轉錄反應。采用SYBR(@) Premix Ex TaqTMⅡ(Perfect Real Time)試劑盒分別擴增MDIG、p18INK4c、p19INK4d、p21 WAF/CIP1、p27KIP1、p57KIP2、cyclin D1及cyclin E1。采用雙標準曲線法進行相對定量分析。
　　5、蛋白質免疫印跡(WB)檢測
　　

10、提取細胞或組織中的總蛋白;BCA法測定蛋白質濃度;將80μg總蛋白進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉印至PVDF膜;抗MDIG抗體、抗ACTIN抗體、抗p27KIP1抗體、抗第10位絲氨酸磷酸化p27KIP1蛋白（p-p27KIP1（Ser10））抗體或抗第187位蘇氨酸磷酸化p27KIP1蛋白(p-p27KIP1(Thr187))抗體4℃孵育過夜;相應二抗室溫孵育2小時后化學發(fā)光法顯色;UVP成像系統(tǒng)成像;Gel-Pro4.0圖像分析軟

11、件分析灰度值。
　　6、四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測細胞增殖
　　將單個細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，進行siRNA干擾實驗后，每孔加入20μlMTT溶液(5mg/ml)，培養(yǎng)4小時，每孔加入150μl二甲基亞砜(DMSO)，酶標儀測定各孔490nm波長的吸光值。
　　結果：
　　1、在A549細胞中轉染mdig siRNA可抑制細胞增殖、使細胞由G1期向S期轉換延遲。
　　A549細胞中轉染mdig s

12、iRNA使細胞內MDIG mRNA和蛋白表達水平下調80％以上。與對照組相比，轉染組細胞增殖明顯下降，細胞由G1期向S轉換延遲。
　　2、在A549細胞中轉染mdig siRNA對細胞周期基因p18 INK4c、p19INK4d、p21 WAF/CIP1、p27KIP1、p57KIP2、cyclinD1及cyclinE1 mRNA水平的影響。
　　在A549細胞中轉染mdig siRNA后，發(fā)現INK4蛋白家族成員p18IN

13、K4c、p19INK4dmRNA水平輕度下調，而CIP/KIP蛋白家族成員p21WAF/CIP1、p27KIP1、p57KIP2mRNA水平均上調，其中，p27KIP1mRNA水平明顯提高，其下游基因cyclinE1mRNA水平也輕度下調，而cyclinD1 mRNA水平在轉染后48小時略有下降，但在轉染后72小時則明顯上升。
　　3、在A549細胞中轉染mdig siRNA對p27KIP1蛋白水平的影響。在A549細胞中轉染md

14、ig siRNA72小時后，發(fā)現p27KIP1蛋白水平上調，p-p27KIP1(Ser10)蛋白水平隨著總p27KIP1蛋白水平提高而提高，但p-p27KIP1(Thr187)蛋白水平無明顯變化，提示:MDIG siRNA可能通過抑制p27 KIP1蛋白上第187位蘇氨酸磷酸化位點的蛋白質磷酸化而抑制p-p27KIP1蛋白的降解。
　　4、MDIG蛋白在肺癌組織及癌旁正常肺組織中表達情況。
　　在25例接受手術治療的肺癌患者

15、中，肺癌組織及癌旁正常肺組織中MDIG蛋白平均表達量之比為:2.14∶1，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。其中，在肺鱗癌、腺癌、小細胞癌及腺鱗癌組織中MDIG蛋白的表達量明顯高于癌旁正常肺組織中該蛋白的表達量(p＜0.05)。
　　5、p27KIP1蛋白在肺癌組織及癌旁正常肺組織中表達情況。
　　在全部肺癌患者中，肺癌組織及癌旁正常肺組織中p27KIP1蛋白表達量無明顯差異(p＞0.05)。在各種類型的肺癌組織及癌旁肺組織

16、中p27KIP1蛋白表達量均無明顯差異。
　　6、在肺癌患者體內，MDIG蛋白與p27KIP1蛋白表達的相關性分析。
　　在全部25例肺癌組織中，MDIG蛋白與p27KIP1蛋白表達量無明顯相關性。但在9例患者的癌組織中可觀察到MDIG蛋白表達上調并伴有p27KIP1蛋白表達下調。
　　結論：
　　在A549細胞中轉染靶向MDIG基因siRNA可抑制細胞增殖，使細胞阻滯在G1期，表明mdig的促細胞增殖作用主要作

17、用在細胞周期的G1期。
　　mdig siRNA可上調p27KIP1的表達，并可抑制p27KIP1蛋白上的第187位蘇氨酸位點磷酸化，提示MDIG的促細胞增殖作用乃至致癌活性可能是通過促進p27KIP1蛋白上的第187位蘇氨酸磷酸化而抑制p27KIP1的表達，從而影響細胞周期進程。
　　各種類型的肺癌組織中MDIG蛋白表達量均明顯高于癌旁正常肺組織中的表達量。然而p27KIP1蛋白的表達量在癌組織和癌旁正常肺組織中無明顯差別