染色體核型及轉錄因子SOHLH2、NR5A1在卵巢早衰發(fā)病機制中的作用研究.pdf

1、第一部分:中國漢族卵巢早衰患者染色體核型分析
　　背景:
　　卵巢早衰(POF)是一種臨床特征高度異質、病因復雜的婦科內分泌疾病，40歲前發(fā)病率約為1％，近年來發(fā)病呈上升趨勢。目前尚無可靠指標早期診斷，也無有效措施改善卵巢功能，因而病因研究及識別高風險人群十分必要。染色體畸變是POF目前已明確的病因之一，但其發(fā)生率報道不一。既往有多種染色體畸變類型在POF中報道，但大樣本POF人群的核型研究較少見。最常見的異常核型是X染色體

2、畸變，45，X和X短臂異常POF患者中，50％表現(xiàn)為原發(fā)性閉經(jīng)和性腺發(fā)育不全，而45，X的嵌合體、Xq缺失及X-常染色體易位患者較多表現(xiàn)為繼發(fā)性閉經(jīng)。部分染色體畸變類型的POF攜帶者可將致病畸變傳遞給子代。因此，在大樣本中國漢族POF患者中明確染色體畸變的發(fā)生率、異常核型的分布特征及與臨床表型的相關性意義重大。
　　目的:
　　本研究旨在通過大樣本中國漢族POF患者染色體核型分析，明確染色體畸變的發(fā)生率及其分布特征，闡明畸變

3、核型與臨床表型的相關性，為POF病因學研究及臨床遺傳咨詢和生育指導提供理論基礎。
　　方法:
　　募集2003年～2011年就診的中國漢族POF患者531例，置備中期分裂相染色體進行G顯帶核型分析，明確染色體畸變的發(fā)生率及各不同異常核型的分布;識別染色體畸變發(fā)生的熱點區(qū)域;按臨床閉經(jīng)類型分組，比較兩組間染色體畸變的分布差異;結合臨床表型及內分泌特征，分析染色體核型與臨床表型的相關性。
　　結果:
　　研究發(fā)現(xiàn)染色

4、體畸變的發(fā)生率為12.1％(64/531)，X染色體異常約占93.7％(60/64)。最為常見的染色體畸變?yōu)閄染色體結構異常，包括15例Xq缺失，2例Xp缺失，11例等臂染色體（6例短臂等臂，5例長臂等臂），1例環(huán)狀染色體，1例倒位染色體，1例雙著絲粒染色體和1例復雜重排。識別9例非嵌合X-常染色體易位，除1例外均涉及X染色體長臂(Xq22-Xq24)。不伴有X染色體結構異常的非整倍體19例，包括7例非嵌合45，X單體，9例45，X嵌合

5、體，3例47，XXX三體。原發(fā)性閉經(jīng)組染色體畸變率(21.4％，12/70)明顯高于繼發(fā)性閉經(jīng)組(10.6％，49/461)(P=0.01)。45，X單體及其嵌合與原發(fā)性閉經(jīng)表型關聯(lián)性最高(46.7％)。3例含46，XY細胞系患者中，2例表現(xiàn)為繼發(fā)性閉經(jīng)。另檢測到1例罕見的常染色體羅伯遜平衡易位。
　　結論:
　　首次大樣本中國漢族POF患者染色體核型分析發(fā)現(xiàn)染色體畸變發(fā)生率為12.1％，X染色體異常率占93.7％，證實染色

6、體異常，尤其是X染色體異常是POF的重要病因之一，有助于正確的生育指導和遺傳咨詢，為定位卵子發(fā)育相關區(qū)域及確定POF候選基因提供有價值的參考。
　　第二部分:生殖細胞特異性轉錄因子SOHLH2基因變異與卵巢早衰的相關性研究
　　背景:
　　始基卵泡池的大小及其耗竭速率是女性生殖壽命和生育潛能的重要決定因素。卵泡和卵子發(fā)生是多種信號通路交互協(xié)調的動態(tài)過程，生殖細胞特異性的關鍵基因準確有序地轉錄和表達至關重要，這需要生殖細

7、胞特異性的轉錄調控因子的精細操縱。既往研究發(fā)現(xiàn)生殖細胞特異性轉錄因子FIGLA、NOBOX、LHX8、SOHLH1和SOHLH2等可形成獨特而復雜的轉錄調控網(wǎng)絡，調節(jié)生殖細胞眾多關鍵基因（BMP15、GDF9、ZP1-3等）的時空特異性表達，維持卵泡發(fā)生發(fā)育和正常卵巢功能。SOHLH2基因編碼早期精卵發(fā)生特異性的轉錄因子，在胚胎生殖細胞簇，始基卵泡和初級卵泡的卵母細胞限制性表達，在卵泡早期分化發(fā)育中發(fā)揮重要作用。Sohlh2-/-雌鼠卵

8、巢內始基卵泡向初級卵泡過渡障礙，卵泡提早耗竭，導致不育，類似人非綜合征型POF的臨床表型。因此SOHLH2可作為POF的重要候選基因。
　　目的:
　　本研究通過對364例中國漢族及197例塞爾維亞POF患者進行SOHLH2基因突變篩查，探討SOHLH2基因變異與不同種族POF發(fā)病機制的相關性。
　　方法:
　　以364例中國漢族POF患者和197例塞爾維亞POF患者為研究對象，同時分別募集400例和200例相同

9、種族的健康女性為正常對照。采用直接測序法篩查兩個不同種族POF患者SOHLH2基因的突變情況，并利用多種預測軟件對識別的新發(fā)變異進行序列比對和功能預測。
　　結果:
　　直接測序結果共發(fā)現(xiàn)11種SOHLH2基因的新發(fā)變異，其中錯義變異包括在中國漢族POF患者中發(fā)現(xiàn)的p.Glu79Lys(2例)、p.Glu105Gly和p.Thr321Pro，和在塞爾維亞POF患者中發(fā)現(xiàn)的p.Leu120Phe（3例）和p.Leu204Phe

10、。蛋白序列比對僅發(fā)現(xiàn)錯義變異p.Glu79Lys和p.Glu105Gly涉及在哺乳動物中高度保守的氨基酸，功能預測為致病性。在中國漢族POF患者中發(fā)現(xiàn)1例c.-210G＞T，該基因變異位于富集轉錄因子結合位點和CpG島的核心啟動子區(qū)。在塞爾維亞POF發(fā)現(xiàn)的新發(fā)變異中，預測內含子變異c.530+6T＞G可能通過影響RNA剪切導致轉錄本無義降解，繼而發(fā)揮致病作用。因此本研究在兩個不同種族POF患者中識別的新發(fā)變異可能通過影響SOHLH2的轉

11、錄、蛋白表達及同源/異源二聚體的形成而導致卵巢衰竭。
　　結論:
　　本研究在中國漢族和塞爾維亞兩個不同種族POF患者中發(fā)現(xiàn)11種SOHLH2基因新發(fā)變異，提示SOHLH2基因變異是POF的致病機制之一，同時進一步印證轉錄因子SOHLH2在早期卵泡和卵子發(fā)生中發(fā)揮的重要作用。
　　第三部分:體細胞轉錄因子NR5A1基因突變在卵巢早衰發(fā)病機制中的作用研究
　　背景:
　　卵巢早衰(POF)病因具高度遺傳異質性

12、，多數(shù)患者病因尚不明確。體細胞轉錄因子的調控對卵泡和卵子發(fā)生至關重要。NR5A1基因編碼類固醇生成因子SF1，是參與腎上腺、性腺發(fā)育，類固醇生成和生殖過程的關鍵轉錄因子。卵巢中SF1主要表達于顆粒細胞、卵泡膜細胞及黃體等體細胞，可調控STAR、CYP11A1、CYP19A1、AMH、INHA及LHB轉錄，在卵巢類固醇生成、卵泡生長成熟過程中發(fā)揮重要作用。顆粒細胞特異性Nr5a1敲除雌鼠表現(xiàn)為不孕，卵巢內卵泡減少，缺乏黃體，提示NR5A1

13、基因變異可能參與人卵巢早衰發(fā)病機制。
　　目的:
　　本研究旨在通過對400例中國漢族特發(fā)性非綜合征型POF患者進行NR5A1基因突變篩查，并對識別的新發(fā)變異進行功能預測及體外功能實驗驗證，探討該基因變異與POF發(fā)病的相關性。
　　方法:
　　以2003年-2012年就診于山東大學附屬生殖醫(yī)院的400例中國漢族POF患者為研究對象，同時募集400例卵巢功能正常的育齡期健康女性為正常對照，應用直接測序技術對NR5A

14、1基因編碼區(qū)進行突變篩查。應用AlignGVGD、Polyphen-2和SIFT進行功能預測，通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測轉錄活性，細胞免疫熒光染色技術檢測蛋白表達及細胞定位三方面探討新發(fā)變異的致病作用。
　　結果:
　　在400例中國漢族特發(fā)性非綜合征型POF患者中發(fā)現(xiàn)1個新發(fā)變異c.13T＞G(p.Tyr5Asp，p.Y5D)，該雜合錯義變異位于第二外顯子。突變的酪氨酸位于DNA結合結構域上游，在各物種中高度保守。體外實驗