HPV經Wnt通路致宮頸癌上皮-間質轉化的研究.pdf

1、目的:本實驗通過分別構建針對HPV16E6、E7和HPV18E6、E7的microRNA(miRNA)干擾載體并轉染HPV16陽性的宮頸癌細胞株SiHa和HPV18陽性的HeLa細胞，抑制癌基因E6、E7的表達，觀察E6、E7基因沉默對上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)的相關基因——β-catenin、E-cadherin和N-cadherin和Wnt/β-catenin信號通路表

2、達的影響，分析HPV與宮頸癌細胞發(fā)生EMT的相關性，闡明HPV導致宮頸細胞發(fā)生EMT的可能信號通路機制，為以HPV為靶點的宮頸癌的基因治療提供系統(tǒng)的理論依據。
　　 方法:1.培養(yǎng)HPV16陽性的人宮頸癌細胞株SiHa和HPV18陽性的人宮頸癌細胞株HeLa。
　　 2.miRNA干擾質粒的構建及質粒提取:分別構建針對HPV16E6、HPV16E7、HPV18E6、HPV18E7的miRNA干擾質粒，以及1個陰性對照mi

3、croRNA干擾質粒。分別中提各質粒以用于瞬時和穩(wěn)定轉染過程。
　　 3.瞬時轉染和轉染效率的測定:利用脂質體轉染技術分別轉染人宮頸癌細胞株SiHa和HeLa，瞬時轉染48小時后通過倒置熒光顯微鏡觀察細胞并計數(shù)，計算轉染效率。
　　 4.穩(wěn)定轉染:構建的干擾載體含對殺稻瘟菌素的抗性，故分別用不同濃度的殺稻瘟菌素作用于宮頸癌細胞SiHa和HeLa，確定宮頸癌細胞SiHa和HeLa的篩選濃度及維持濃度;進而建立相應的穩(wěn)定轉染

4、的細胞。
　　 5.實時定量PCR(Real-TimePCR)技術檢測各組靶基因的干擾效率:分別以SiHa和HeLa細胞為陰性對照，檢測各干擾質粒和陰性對照質粒轉染宮頸癌細胞后對各自靶基因HPV16E6和E7、HPV18E6和E7mRNA表達的影響，計算各自的干擾效率，篩選出干擾效率最高的質粒用于后續(xù)實驗。
　　 6.EMT相關基因的檢測:為進一步研究HPV與宮頸癌EMT的相關機制，利用Real-TimePCR技術，檢測

5、HPV被干擾前后Wnt1、β-catenin、E-cadherin及N-cadherin的表達情況，分別以未轉染的SiHa和HeLa細胞為陰性對照。
　　 結果:1.倒置相差顯微鏡觀察人宮頸癌細胞株SiHa和HeLa均生長旺盛，細胞形態(tài)呈現(xiàn)多樣化。
　　 2.倒置熒光顯微鏡觀察和計數(shù)用各干擾質粒及陰性對照質粒瞬時轉染48小時后熒光陽性細胞占所有細胞的比例，轉染效率可達70-80％。
　　 3.干擾效率的檢測:針對

6、SiHa細胞系，以未轉染的SiHa細胞為陰性對照，各組分別以各自的GAPDH為內參照，Real-TimePCR技術檢測發(fā)現(xiàn)轉染干擾質粒HPV16E6-miRNA后，HPV16E6mRNA的表達量較SiHa細胞組降低，對HPV16E6的干擾效率達77.8％，而經HPV16E7-miRNA2、HPV16E7-miRNA4轉染后HPV16E7rnRNA的表達量較SiHa細胞組降低，對HPV16E7的干擾效率分別為67.3％和59.4％，可見H

7、PV16E7-miRNA2具有更高的干擾效率。而轉染陰性對照質粒(Neg-miRNA)組與SiHa細胞相比，HPV16E6和E7mRNA的表達均無明顯變化(P＞0.05)，說明陰性對照質粒不影響SiHa細胞HPV16E6和E7mRNA的表達。
　　 針對HeLa細胞系，以未轉染的HeLa細胞為陰性對照，以GAPDH為內參照，Real-TimePCR檢測示轉染HPV18E6-miRNA后，HPV18E6mRNA的表達量較HeLa細

8、胞組降低，對HPV18E6mRNA的干擾效率達87.3％，而經HPV18E7-miRNA1、HPV18E7-miRNA4轉染后HPV18E7mRNA的表達量較HeLa細胞組降低，對HPV18E7的干擾效率分別為68％和45.5％，可見HPV18E7-miRNA1具有更高的干擾效率。而轉染陰性對照質粒(Neg-miRNA)組與HeLa細胞相比，HPV18E6和E7mRNA的表達均無明顯變化(P＞0.05），說明陰性對照質粒不影響HeLa細

9、胞HPV16E6和E7mRNA的表達。說明HPV18E6-miRNA和HPV18E7-miRNA1能高效的轉染人宮頸癌細胞株HeLa，并分別使靶基因HPV18E6和E7在mRNA水平上受到了抑制。
　　 故可用質粒HPV16E6-miRNA、HPV16E7-miRNA2、HPV18E6-miRNA、HPV18E7-miRNA1、Neg-miRNA作為后續(xù)穩(wěn)定轉染的目的質粒。
　　 4.SiHa和HeLa細胞篩選濃度和維持

10、濃度的確定:經含不同濃度的殺稻瘟菌素的培養(yǎng)基培養(yǎng)10天的SiHa和HeLa細胞，均在殺稻瘟菌素濃度≥9ug/ml時全部死亡，故確定用于穩(wěn)定轉染的篩選濃度為10ug/ml，維持濃度為5ug/ml。
　　 5.EMT相關基因的表達檢測:①E-cadherin和N-cadherin的表達情況:Real-TimePCR結果示SiHa和HeLa細胞中E-cadherin均低表達，而N-cadherin均高表達。敲除HPVE6、E7基因后的

11、SiHa和HeLa細胞E-cadherin表達均明顯升高，N-cadherin的表達均明顯降低，P均＜0.05。同樣，較未轉染組陰性對照質粒組無明顯變化，提示干擾HPVE6、E7基因的表達可使E-cadherin的表達上調、N-cadherin的表達下調，因而HPVE6、E7與宮頸癌發(fā)生EMT相關。②Wnt1和β-catenin的表達情況:以未轉染的SiHa和HeLa細胞為陰性對照，以管家基因GAPDH為內參，利用Real-TimePC

12、R技術檢測各轉染組細胞中Wnt1和β-catenin的表達變化。SiHa細胞經HPV16E6-MiRNA、HPV16E7-MiRNA2轉染后較未轉染組Wnt1和β-catenin表達均明顯降低(P均＜0.05）。同樣，在HeLa細胞中經HPV18E6-MiRNA、HPV18E7-MiRNA1轉染的細胞的Wnt1和β-catenin的表達發(fā)生同樣變化，而陰性對照質粒則無明顯變化，提示干擾HPVE6、E7基因的表達可抑制Wnt1和β-cat

13、enin的表達，因而在宮頸癌中HPVE6、E7可激活EMT的信號通路之一——經典的Wnt/β-catenin信號通路，促進宮頸癌的發(fā)生。
　　 結論:1.成功構建了針對HPVE6、E7的miRNA干擾載體，同時篩選出了有效的干擾質粒，可以直接干擾細胞內目的基因的表達，而陰性對照質粒則不引起相應變化，對細胞內原有基因的表達無明顯作用;同時篩選出了相應的穩(wěn)定轉染細胞株，為進一步研究HPVE6、E7對宮頸癌的影響提供了實驗基礎。2.H