干旱脅迫下咖啡酸對(duì)黃瓜基因組DNA甲基化的影響及一個(gè)甲基化差異基因的功能分析.pdf

1、非生物脅迫如干旱、低溫一直都是對(duì)植物影響較大的自然災(zāi)害。黃瓜作為我國(guó)主要栽培蔬菜之一，具有葉片大、根系淺等特點(diǎn)，需水量大且對(duì)水分反應(yīng)特別敏感。干旱是夏、秋季節(jié)黃瓜育苗生產(chǎn)中存在的主要問(wèn)題，因此探明干旱脅迫對(duì)黃瓜生長(zhǎng)的影響以及緩解脅迫的方法對(duì)黃瓜的栽培和生長(zhǎng)具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)探究了外源咖啡酸(CA)緩解黃瓜幼苗干旱脅迫的機(jī)制，研究了外源CA對(duì)干旱脅迫下黃瓜幼苗生理生化的相關(guān)指標(biāo)及基因組DNA甲基化的影響，并分離了干旱脅迫下CA誘導(dǎo)的DN

2、A甲基化差異片段，然后進(jìn)一步對(duì)這些差異片段進(jìn)行克隆及測(cè)序。本文旨在從宏觀、微觀、生理和分子水平上揭示外源CA緩解干旱和低溫脅迫的機(jī)制，為生產(chǎn)中科學(xué)應(yīng)用CA及黃瓜耐干旱栽培提供更多的理論和實(shí)踐依據(jù)。外源過(guò)氧化氫(H2O2)緩解干旱脅迫時(shí)分離得到兩個(gè)甲基化差異基因，本課題利用絕對(duì)熒光定量PCR技術(shù)分析了兩個(gè)基因的表達(dá)情況，此外還利用黃瓜授粉后外源基因直接導(dǎo)入技術(shù)將其中的一個(gè)基因轉(zhuǎn)入黃瓜，利用PCR檢測(cè)獲得陽(yáng)性植株，進(jìn)而對(duì)該基因做了初步的功能

3、分析。為深入闡明黃瓜對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)機(jī)理打下基礎(chǔ)。具體研究結(jié)果如下:
　　(1)外源CA緩解干旱脅迫時(shí)對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)量、抗氧化酶及其相關(guān)指標(biāo)的影響
　　干旱脅迫明顯導(dǎo)致了“津春四號(hào)”黃瓜幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)的下降，而用外源CA預(yù)處理黃瓜幼苗，其生長(zhǎng)量顯著增加。所以，干旱脅迫嚴(yán)重影響了黃瓜幼苗的正常生長(zhǎng)，而外源CA處理能夠緩解干旱的抑制作用。
　　在本實(shí)驗(yàn)中，干旱脅迫使黃瓜幼苗葉片的丙二醛(MDA)和內(nèi)源H2O2含量以及02·-

4、的產(chǎn)生速率高于對(duì)照。但用外源CA預(yù)處理后再進(jìn)行干旱脅迫時(shí)增強(qiáng)了葉片的超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、愈創(chuàng)木酚過(guò)氧化物酶(GPX)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)、單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)和谷胱甘肽還原酶(GR)等抗氧化物酶的活性，提高了抗氧化物抗壞血酸(AsA)和還原型谷胱甘肽(GSH)的含量、以及脯氨酸和可溶性糖的含量，從而降低了葉片中MDA和

5、內(nèi)源H2O2的產(chǎn)生速率。我們推斷，外源CA預(yù)處理提高了黃瓜葉片抗氧化酶的活性，減少了活性氧含量，進(jìn)而減輕了干旱脅迫對(duì)葉片膜系統(tǒng)的傷害。這一推斷利用熒光定量在基因表達(dá)水平上進(jìn)一步得到驗(yàn)證。
　　(2)外源CA處理對(duì)干旱脅迫下黃瓜基因組DNA甲基化的影響
　　通過(guò)對(duì)黃瓜葉片基因組DNA進(jìn)行甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(MSAP)分析，發(fā)現(xiàn)干旱脅迫影響黃瓜葉片中基因組DNA的甲基化水平。外源CA預(yù)處理會(huì)使其DNA甲基化狀態(tài)進(jìn)一步發(fā)生改變。

6、
　　(3)外源H2O2誘導(dǎo)的干旱處理下兩個(gè)甲基化差異基因HG-1和HG-2的表達(dá)及HG-2的功能分析
　　干旱下外源H2O2誘導(dǎo)的甲基化差異基因HG-1表達(dá)量在根、第二片真葉及第一片真葉均呈現(xiàn)H2O2+PEG處理組低于PEG處理組的趨勢(shì)，而在莖和子葉中該基因的表達(dá)量與在根、第二片真葉及第一片真葉中的相反。黃瓜幼苗不同組織部位中的甲基化差異基因HG-2的表達(dá)量在H2O2+PEG處理組均低于PEG處理組，表明在干旱脅迫下經(jīng)H2

7、O2誘導(dǎo)后該基因“下調(diào)”表達(dá)。
　　利用PCR技術(shù)克隆HG-2基因全長(zhǎng)的cDNA序列，將獲得的全長(zhǎng)序列與含有35s啟動(dòng)子的pBI121載體重組，構(gòu)建反義表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化黃瓜，用PCR方法鑒定獲得轉(zhuǎn)反義基因陽(yáng)性植株。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)反義HG-2基因的植株比野生型表現(xiàn)出對(duì)干旱更強(qiáng)的耐受性，且其內(nèi)源H2O2水平明顯降低，GPX、GR、GSH-Px、DHAR和MDHAR等抗氧化物酶的活性顯著增強(qiáng)，抗氧化物AsA和GSH的含量也顯著升高，初步表明