24nt-siRNA在水稻強(qiáng)弱粒藻漿充實(shí)中的功能及作用機(jī)制研究.pdf

1、24nt-siRNAs是水稻籽粒中數(shù)量最多的小干擾RNA，在水稻的強(qiáng)弱勢(shì)粒灌漿期間呈規(guī)律性分布:隨著灌漿的持續(xù)，強(qiáng)勢(shì)粒和弱勢(shì)粒中24nt-siRNA的表達(dá)量逐漸降低，但各個(gè)時(shí)期弱勢(shì)粒中24nt-siRNA表達(dá)量都高于強(qiáng)勢(shì)粒。因此研究籽粒中24nt-siRNA表達(dá)量變化對(duì)水稻強(qiáng)弱勢(shì)籽粒灌漿充實(shí)的影響具有重要意義。
　　采用亞硫酸鹽測(cè)序法檢測(cè)了新豐2號(hào)第12條染色體上一個(gè)DNA區(qū)段胞嘧啶甲基化狀態(tài)，5'RACE擴(kuò)增法檢測(cè)了24nt-s

2、iRNA對(duì)靶基因的切割。根據(jù)簡(jiǎn)易R(shí)NAi構(gòu)建法分別構(gòu)建了三個(gè)水稻胚乳特異性干擾載體DCL3ai、polIVi和RDR2i，得到三類RNAi轉(zhuǎn)基因株系T0代，并對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系目的基因表達(dá)量和籽粒表型進(jìn)行了檢測(cè)。主要結(jié)果如下:
　　1.亞硫酸鹽測(cè)序法結(jié)果表明，強(qiáng)弱勢(shì)粒間DNA甲基化水平存在一定差異。強(qiáng)勢(shì)粒中CG，CHG和CHH三類胞嘧啶甲基化水平都高于弱勢(shì)粒，其中CHG和CHH類占靶基因總胞嘧啶的72.5％，兩者甲基化水差異顯著(P

3、＜0.05)，而強(qiáng)弱勢(shì)粒間CG類甲基化水平高達(dá)98％，但不存在差異。24nt-siRNA的RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果表明，弱勢(shì)粒24nt-siRNA表達(dá)量高于強(qiáng)勢(shì)粒。強(qiáng)弱勢(shì)粒間CHG和CHH類甲基化差異是導(dǎo)致DNA甲基化差異的主要原因，而弱勢(shì)粒24nt-siRNA表達(dá)量高可能是由于甲基化水平低造成的。
　　2.從新豐2號(hào)強(qiáng)弱勢(shì)粒籽粒小RNA靶基因的預(yù)測(cè)結(jié)果中，挑選9個(gè)靶基因進(jìn)行5'RACE的切割驗(yàn)證。通過靶基因擴(kuò)增和TA克隆，得到了3個(gè)

4、靶基因的TA克隆，測(cè)序結(jié)果分析表明只有基因LOC_Os06g19990測(cè)序正確。根據(jù)LOC-Os06g19990靶基因的序列和siRNA的測(cè)序結(jié)果，搜集了分布在LOC_Os06g19990的5'RACE接頭附近的siRNA共13個(gè)。對(duì)這13個(gè)siRNA的堿基序列，堿基長(zhǎng)度，TPM和靶基因切割位點(diǎn)對(duì)應(yīng)siRNA的5'端堿基位置進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，表明24nt長(zhǎng)度的siR478391與靶基因序列完全互補(bǔ)，TPM相對(duì)較高，切割點(diǎn)對(duì)應(yīng)siR4783

5、91中間區(qū)段5，端第9和10個(gè)堿基之間，切割靶基因LOC-Os06g19990的可能性最大。
　　3.采用簡(jiǎn)易R(shí)NAi構(gòu)建法成功構(gòu)建了3個(gè)水稻籽粒胚乳特異性啟動(dòng)子Gt13a啟動(dòng)的簡(jiǎn)易R(shí)NAi干擾載體:DCL3ai、polIVi和RDR2i，并用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法得到三類RNAi轉(zhuǎn)基因水稻的T0代。對(duì)RNAi轉(zhuǎn)基因水稻葉片進(jìn)行GUS染色，發(fā)現(xiàn)共有10株RNAi轉(zhuǎn)基因葉片切口處呈現(xiàn)出藍(lán)色。RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這10株轉(zhuǎn)基因水稻籽粒中目