膽囊癌差異表達基因分析及AXL、Prostasin在膽囊癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用研究.pdf

1、第一部分膽囊癌差異表達基因分析。
　　 目的：
　　 應(yīng)用基因芯片技術(shù)比較膽囊癌GBC-SD細胞和正常膽囊上皮細胞的差異基因，為探討膽囊癌侵襲轉(zhuǎn)移機制提供實驗依據(jù)，并為進一步深入研究膽囊癌的干預(yù)治療奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 培養(yǎng)正常膽囊上皮細胞及膽囊癌GBC-SD細胞株，分別提取兩組細胞的總RNA，純化后進行熒光標(biāo)記，在含有21522個轉(zhuǎn)錄本的人基因組寡核苷酸芯片上進行雜交，用LuxScan10KA

2、雙通道激光掃描儀進行掃描，根據(jù)熒光強度篩選出兩者的差異基因，最后用在線分子注釋系統(tǒng)(MAS2.0)進行生物信息學(xué)分析。
　　 結(jié)果：
　　 成功地進行了基因芯片實驗，共篩選出2288個在膽囊癌GBC-SD細胞和正常膽囊細胞之間差異表達的基因。814個基因在膽囊癌細胞組中表達上調(diào)，1474個基因在膽囊癌細胞組中表達下調(diào)，基因功能分類注釋系統(tǒng)分類(GO分類)涉及氧化還原、DNA依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細胞周期、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白結(jié)合、鋅

3、離子結(jié)合、細胞核成分等；信號通路(Pathway)分析涉及到細胞周期蛋白依賴性激酶調(diào)節(jié)、固有凝血酶原激活通路、氧化通路、細胞周期調(diào)節(jié)、血小板淀粉樣前體蛋白途徑等。
　　 結(jié)論：
　　 通過正常膽囊上皮細胞及膽囊癌GBC-SD細胞之間基因表達譜的比較分析，發(fā)現(xiàn)了許多新的差異表達的基因，差異基因涉及多種功能蛋白和信號通路，結(jié)合文獻分析認為AXL及Prostasin可能涉及到膽囊癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程，將作為我們下一步的研究對象。<

4、br>　　 第二部分AXL、Prostasin基因及蛋白在膽囊癌組織中的表達及意義。
　　 目的：
　　 通過檢測膽囊腺癌和慢性膽囊炎組織中AXL及Prostasin的mRNA及蛋白質(zhì)的表達情況，探討其在膽囊癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用，同時對第一部分基因芯片的結(jié)果加以驗證。
　　 方法：
　　 分別收集15例膽囊腺癌及15例慢性膽囊炎新鮮組織標(biāo)本，提取組織的總RNA及總蛋白，用RT-PCR檢測AXL及Prost

5、asin mRNA的表達；用Western-blot檢測AXL及Prostasin的蛋白質(zhì)表達，然后進行統(tǒng)計分析。
　　 結(jié)果：
　　 1、AXL mRNA在膽囊腺癌中的表達明顯上調(diào)，與慢性膽囊炎比較有顯著差異(1.032±0.031 vs0.293±0.026，P<0.01)；而ProstasinmRNA在膽囊腺癌中的表達明顯下調(diào)，兩者比較有顯著差異(0.085±0.023 vs0.721±0.027，P<0.01)。

6、
　　 2、AXL蛋白在膽囊腺癌中的表達明顯上調(diào)，與慢性膽囊炎比較有顯著差異(0.889±0.029 vs0.409±0.017，P<0.01)；而Prostasin蛋白在膽囊腺癌中的表達明顯下調(diào)，兩者比較有顯著差異(0.094±0.011vs0.721±0.031，P<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 通過與慢性膽囊炎組織相比較膽囊腺癌組織中AXL mRNA及其蛋白均高表達而Prostasin均低表達，這與第一

7、部分基因芯片的結(jié)果相一致，AXL、Prostasin基因可能涉及到膽囊癌細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的調(diào)節(jié)，與膽囊癌的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。
　　 第三部分 RNA干擾抑制AXL基因表達對膽囊癌細胞株GBC-SD生物學(xué)特性的影響。
　　 目的：
　　 觀察轉(zhuǎn)染干擾載體pRNA-siAXL對膽囊癌細胞系GBC-SD體外侵襲能力、增殖活性等生物學(xué)行為的影響，以及對上皮及間質(zhì)標(biāo)記物基因CDH1及VIM的表達的影響。
　　 方

8、法：
　　 以轉(zhuǎn)染無關(guān)序列pRNA-siNC及未轉(zhuǎn)染的膽囊癌細胞系GBC-SD作為對照，將構(gòu)建好的3組干擾載體pRNA-siAXL-1、2和3及無關(guān)序列載體siRNA-NC轉(zhuǎn)染至膽囊癌細胞系GBC-SD，通過熒光顯微鏡檢測轉(zhuǎn)染結(jié)果，篩選出轉(zhuǎn)染效率最高的為pRNA-siAXL-1。利用RT-PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染載體pRNA-siAXL-1前后膽囊癌細胞系GBC-SD中AXL、CDH-1、VIM mRNA的變化，MTT法檢測轉(zhuǎn)染前后細

9、胞增殖活性的變化，Transwell小室侵襲實驗、劃痕試驗檢測轉(zhuǎn)染前后對細胞體外侵襲能力的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1、通過熒光倒置顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染干擾載體pRNA-siAXL及轉(zhuǎn)染pRNAi-NC中均見綠色熒光表達，pRNA-siAXL-1組轉(zhuǎn)染效率最高，證明轉(zhuǎn)染成功，而未轉(zhuǎn)染組無熒光顯示，我們選定pRNA-siAXL-1組作為我們下一步的研究對象。
　　 2、RT-PCR顯示轉(zhuǎn)染干擾載體pRNA-siA

10、XL-1組、轉(zhuǎn)染無關(guān)序列載體pRNAi-NC組及未轉(zhuǎn)染的膽囊癌細胞共3組中AXL mRNA的相對表達量分別為2.846±0.223、8.261±0.718、9.269±0.845；CDH1 mRNA的相對表達量分別為5.110±0.312、1.023±0.127、1.276±0.326；VIMmRNA的相對表達量分別為0.890±0.134、4.995±0.623、5.274±0.715。經(jīng)統(tǒng)計分析顯示轉(zhuǎn)染干擾載體pRNA-siAXL-

11、1組AXL、VIM mRNA表達量明顯低于轉(zhuǎn)染無關(guān)序列載體pRNAi-NC組及未轉(zhuǎn)染組(P<0.01)；轉(zhuǎn)染干擾載體pRNA-siAXL-1組CDH1 mRNA表達量明顯高于轉(zhuǎn)染無關(guān)序列載體pRNAi-NC組及未轉(zhuǎn)染組(P<0.01)；轉(zhuǎn)染無關(guān)序列載體pRNAi-NC組與未轉(zhuǎn)染組AXL、CDH1、VIM mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　 3、經(jīng)MTT法檢測從第3天開始轉(zhuǎn)染pRNA-si-AXL-1組細胞增殖速

12、度開始低于轉(zhuǎn)染無關(guān)序列載體pRNAi-NC及未轉(zhuǎn)染組，并持續(xù)至第6天(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染無關(guān)序列載體pRNAi-NC和未轉(zhuǎn)染組膽囊癌細胞增殖速度沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。
　　 4、采用Transwell小室侵襲實驗檢測siAXL對膽囊癌細胞系GBC-SD體外侵襲性的影響。通過細胞計數(shù)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，干擾載體pRNA-siAXL-1組、轉(zhuǎn)染無關(guān)序列載體pRNAi-NC組及未轉(zhuǎn)染組穿膜細胞個數(shù)分別是43.6±3.27、71

13、.2±6.45、82.8±7.34，轉(zhuǎn)染干擾載體pRNA-siAXL組的細胞穿膜數(shù)明顯低于轉(zhuǎn)染無關(guān)序列載體pRNAi-NC組及未轉(zhuǎn)染組(P<0.05)。
　　 5、于劃痕后0、48小時在100倍倒置相差顯微鏡下觀察并拍照，結(jié)果顯示劃痕后0小時含有三組細胞的劃痕區(qū)面積基本相等。48小時后，含有pRNA-siAXL-1載體的細胞少量遷移，而含有pRNAi-NC載體及未轉(zhuǎn)染載體的膽囊癌GBC-SD細胞明顯向劃痕區(qū)遷移。
　　

14、結(jié)論：
　　 膽囊癌細胞系GBC-SD轉(zhuǎn)染pRNA-siAXL后，細胞中AXL基因表達明顯受到抑制，同時CDH1基因表達上調(diào)，VIM基因表達下調(diào)，可能與AXL能促進膽囊癌細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程有關(guān)。AXL的下調(diào)使膽囊癌細胞的體外侵襲能力減弱，增殖活性降低。
　　 第四部分膽囊良惡性病變組織中AXL和Prostasin的表達及其臨床病理意義。
　　 目的：
　　 研究膽囊良惡性病變組織中AXL和Prosta

15、sin表達水平并探討其臨床病理意義及在膽囊腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。
　　 方法：
　　 100例膽囊腺癌、46例癌旁組織、15例腺瘤性息肉和35例慢性膽囊炎組織標(biāo)本常規(guī)制作石蠟包埋切片，AXL和Prostasin染色方法為EnVisionTM免疫組化二步法。
　　 結(jié)果：
　　 (1)100例膽囊腺癌中AXL陽性表達為62例(62％)，46例癌旁組織為11例陽性(23.9％)，15例腺瘤性息肉為2例陽性(1

16、3.3％)，35例慢性膽囊炎膽囊上皮為3例陽性(8.6％)，膽囊腺癌AXL表達陽性率明顯高于癌旁組織、腺瘤性息肉和慢性膽囊炎膽囊上皮(P<0.01)；100例膽囊腺癌中Prostasin陽性表達為52例(52％)，46例癌旁組織為39例陽性(84.8％)，15例腺瘤性息肉為13例陽性(86.7％)，35例慢性膽囊炎膽囊上皮為34例陽性(97.1％)，膽囊腺癌Prostasin表達陽性率明顯低于癌旁組織、腺瘤性息肉和慢性膽囊炎膽囊上皮，差

17、異均有顯著或高度顯著性(P<0.05或P<0.01)；AXL陽性表達和(或)Prostasin陰性表達的良性病變的膽囊上皮均呈不同程度的不典型增生。
　　 (2)高分化腺癌、腫塊最大徑<2cm、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、未侵犯周圍組織的病例中AXL表達陽性率明顯低于低分化腺癌、腫塊最大徑≥2cm、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及侵犯周圍組織的病例(P<0.05或P<0.01)；但Prostasin表達陽性率則相反(P<0.05或P<0.01)；
　　

18、(3)經(jīng)Kaplan-Meier單因素生存分析發(fā)現(xiàn)，病理類型、腫塊最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況、侵犯周圍組織狀況及AXL和Prostasin表達狀況均與膽囊癌患者術(shù)后平均生存期均有密切關(guān)系(P<0.05或P<0.01)；AXL表達陽性病例術(shù)后生存期明顯低于陰性表達病例(P<0.05)，而Prostasin表達陽性的病例則相反(P<0.05)。AXL(+)Prostasin(-)比AXL(-)Prostasin(+)患者生存時間有顯著縮短(P<