STAT5在膠質瘤組織及細胞中的激活及功能研究.pdf

1、目的：調查膠質瘤組織中STAT5的激活現象,并探討在體外膠質瘤細胞中磷酸化的STAT5對細胞增殖和侵襲的影響。
　　 材料與方法：
　　 1、組織芯片的制備。
　　 腫瘤樣本來源于中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院和北京天壇醫(yī)院診斷為膠質瘤并接受治療的患者的術中樣本。診斷標準根據WHO標準。本研究基于赫爾辛基宣言標準,并被當地醫(yī)療機構的倫理委員會批準并同意使用來源于兩所醫(yī)院的組織樣本進行科學研究。實驗組標本來源于膠質瘤患者

2、術中瘤組織,對照組非腫瘤樣本來源于癲癇患者行顳葉切除術的腦組織。組織在切除后快速液氮冷凍,福爾馬林固定,石蠟包埋。根據文獻報道,用組織芯片機(Beecher Instruments,SilverSprings,MD,USA)制備組織芯片。組織芯片樣本包括25例散發(fā)星形細胞瘤(Ⅱ級),27例間變星形細胞瘤(Ⅲ級)和124例膠質母細胞瘤(Ⅳ級)。在每個膠質瘤典型病變區(qū)域提取兩個0.6mm孔徑的組織樣本,制作成由352個微點陣構成的組織芯片。

3、另外,選取13例癲癇手術切除的非瘤腦組織制作成組織芯片,作為對照。
　　 2、免疫組化染色。
　　 用石蠟切片機將石蠟包埋的組織芯片的標本切割成厚度為4μm的切片,貼附與防脫載玻片上,65℃烘干30分鐘。將石蠟切片用二甲苯脫蠟,水化,浸入EDTA中,高壓鍋抗原修復。3％H2O2滅活,山羊血清封閉。p-STAT5a/b(Tyr694/Tyr699)(Santa cruz Biotechnology,Inc,CA,USA)抗

4、體1:50稀釋,4℃孵育過夜。陰性對照組用山羊血清替代一抗4℃孵育過夜。HRP標記的二抗(KIT-5930,MaxVision,FuZhou,China)室溫孵育30分鐘。DAB顯色5分鐘。蘇木素復染,Permount(BIOS,Beijing,China)封片。顯微鏡(Olympus Optical,Japan)觀察,圖像采集。
　　 免疫組化染色強度由兩位病理學專家分別進行觀察并結合瘤細胞陽性染色比例和染色強度進行判定。根據

5、兩位專家判定分數的均值,對p-STAT5的表達情況進行進一步的對比評估。瘤細胞陽性染色比例分級如下:0(無瘤細胞著色),1(瘤細胞著色比例＜10％),2(瘤細胞著色比例為10-50％),3(瘤細胞著色比例＞50％)。著色的瘤細胞比例＞20％認為有STAT5的持續(xù)激活。染色強度分為0(無著色),1(弱著色,呈淡黃色),2(中等著色,呈黃褐色),3(強著色,呈棕色)。染色指數的的計算方法如下:染色指數=染色強度×陽性染色比例。染色指數≥4,

6、被認為瘤組織中STAT5的激活水平較高,染色指數＜4,被認為STAT5的激活水平較低。
　　 3、細胞培養(yǎng)和EGF激活實驗。
　　 U87-MG為人腦星形膠質母細胞瘤細胞系,購自上海中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。U87-MG細胞用含有10％胎牛血清、100u/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基在37℃、5％CO2、相對濕度為90％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在EGF刺激前,先將U87-MG細胞用含1‰胎牛

7、血清的培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)12小時,然后用PBS沖洗細胞2次,再加入含100ng/ml EGF的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在RNA干擾實驗中,根據操作手冊指導轉染細胞完畢24小時后,再加入EGF。
　　 4、免疫熒光分析。
　　 用0.25％胰酶消化對數增長期的U87-MG細胞,制成細胞懸液,以6×103細胞/孔加入6孔細胞培養(yǎng)板(內放蓋玻片)。24小時后移去培養(yǎng)基,PBS洗1次,饑餓培養(yǎng)過夜,替換為含100ng/mlEGF的完全培

8、養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)1小時,用4％多聚甲醛固定10分鐘。0.25％Trixton X-100的PBS作用10分鐘,血清封閉1小時。加入p-STAT5抗體(1:50稀釋),4℃孵育過夜,Cy3標記羊抗兔抗體(1:400稀釋),PBS洗3次,室溫孵育2小時。用熒光顯微鏡Leica DMIRE2(LeicaMicrosystems Ltd,Germany)觀測,采集圖像。
　　 5、RNA干擾實驗。
　　 STAT5 siRNA為Dh

9、armacon(Dharmacon RNA Technologies,Lafayette,CO,USA)合成的ON-TARGETplus SMARTpool siRNA。根據操作手冊,用DharmaFECT siRNA轉染試劑將100nM STAT5 siRNA轉染入U87-MG細胞。ON-TARGETplus Non-targeting siRNA作為陰性對照。STAT5的沉默效率用Western Blot檢測。
　　 6、W

10、estern Blot實驗。
　　 按前述的方法進行細胞培養(yǎng),EGF刺激及RNA干擾。EGF處理的細胞,分別在0,15,30,60,120,180,240,300分鐘收集,提取細胞核蛋白。在轉染STAT5 siRNA24小時后,加入EOF,再過48小時收集,提取總蛋白。Bradford法蛋白定量。8％SDS-PAGE蛋白電泳,轉膜。5％脫脂奶粉封閉30分鐘。以p-STAT5為一抗4℃孵育過夜,Histone1為內參;以STAT5

11、為一抗4℃孵育過夜,β-actin為內參。PBST沖洗3次,每次5分鐘。HRP標記的二抗室溫孵育2小時。PBST沖洗3次,每次5分鐘,ECL發(fā)光。
　　 7、半定量RT-PCR。
　　 U87-MG細胞轉染STAT5 siRNA或陰性對照siRNA24小時后,給予EGF刺激,24小時后將各組細胞RNA用Trizol一步法提取出來,并以500ngRNA為模板逆轉錄為cDNA,根據引物Cyclin D1:forward:5'

12、-CTGTGCTGCGAAGTGGAAACCAT-3';reverse:5'-TTCATGGCCAGCGGGAAGACCTC-3',COX-2:forward:5'-TTCAA ATGAGATTGTGGGAAAATTGCT-3';reverse:5'-AGATCATCTCTGCCTGAGTATCTT-3',內參β-actin:forward:5'-AAATCGTGCGTGACATTAA-3';reverse:5'-CTCGTCATACT

13、CCTGCTTG-3'擴增目的基因。引物由TakaraBiotechnology(Dalian,China)合成。PCR儀設定程序為94.0℃30秒,55℃30秒,72℃30秒,共進行25個循環(huán),產物經2％瓊脂糖電泳100V30分鐘,紫外線成像,結果使用Sigma-Gel software進行分析。
　　 8、MTT分析。
　　 我們通過MTT法來研究STAT5 siRNA及EGF對U87-MG細胞增殖的影響。將轉染24

14、小時的細胞胰酶消化制成懸液,計數3次,向96孔板每孔加細胞懸液200μl,約含5000個細胞,然后加入EGF,對照組只加相同體積的培養(yǎng)基。分別在0,24,48,72,96小時取出1個96孔板,每孔加20μl5mg/ml的MTT,37℃繼續(xù)培養(yǎng)4小時,將培養(yǎng)基吸出,每孔加150μlDMSO,震蕩10分鐘。570nm波長檢測吸光值。
　　 9、Transwell侵襲實驗。
　　 將50mg/L基質膠(BD bioscienc

15、e,San Jose,CA,USA)與無血清培養(yǎng)基以1:7比例混合,取50μl鋪于Transwell小室底部膜的上室面,待凝固后進行實驗。將轉染24小時后的U87-MG細胞胰酶消化制成懸液計數3次,向Transwell小室上室內加細胞懸液200μl(含1％FBS),約含2000個細胞。向下室加500μl培養(yǎng)基(含20％FBS),再向上室及下室同時添加EGF,對照組只加同體積的培養(yǎng)基。24小時后,用棉簽擦去基質膠和上室內的細胞。用甲醇和冰

16、乙酸按1:3的比例配制成固定液,將細胞固定30分鐘。風干后,用Giemsa工作液染色10分鐘,200倍視野下隨機選5個視野進行計數。在另外的組別中為了抑制STAT5的磷酸化,細胞用STAT5的特異磷酸化抑制劑Lestaurtinib(CEP701,Cephalon,West Chester,PA,USA)替代siRNA進行實驗。
　　 10、細胞周期分析。
　　 按上述方法進行轉染及EGF刺激,在EGF刺激24小時后收集

17、細胞,不少于1×106。PBS洗2次,70％乙醇-20℃固定12小時,PBS洗1次,碘化丙啶(PI)染色30分鐘,流式細胞儀(BD FACSCalibur CellSorting System)分析。
　　 11、統計學分析。
　　 不同組間的比較用單因素方差分析,所有數據都用Systat軟件進行統計,P＜0.05具有統計學差異。
　　 結果：
　　 1、在膠質瘤組織中STAT5持續(xù)激活。
　　

18、2、在人膠質瘤細胞系U87-MG中,EGF能激活STAT5。
　　 3、STAT5 siRNA無論是否有EGF的刺激均能抑制U87-MG細胞的增殖。
　　 4、STAT5 siRNA無論是否有EGF刺激均可抑制U87-MG細胞的侵襲。
　　 結論：
　　 STAT5在人腦膠質瘤組織及U87-MG細胞系中均有表達;人腦膠質瘤組織中存在STAT5的激活;在體外人膠質瘤細胞系U87-MG中無STAT5的激活,但