表達延邊飼養(yǎng)鵝α干擾素基因重組禽痘病毒的構建及表達產(chǎn)物對鵝細小病毒活性影響的初步研究.pdf

1、干擾素(Interferon，IFN)是由機體細胞產(chǎn)生的一類具有抗腫瘤、抗病毒、調節(jié)免疫功能等多種生物活性的糖蛋白，是機體防御系統(tǒng)的重要組成部分。在眾多干擾素類型中，a干擾素具有廣譜的抗病毒活性和良好的免疫調節(jié)作用，能夠增強機體的免疫力。
　　為了開展延邊飼養(yǎng)鵝α干擾素基因及其重組載體疫苗的研究，本試驗應用植物血凝素（PHA）刺激延邊飼養(yǎng)鵝外周血單核細胞，提取總RNA，采用RT-PCR技術擴增編碼鵝α干擾素的基因，將目的基因經(jīng) T

2、A克隆后進行序列測定分析，將測序正確的經(jīng)雙酶切，構建重組原核表達質粒 pET-30a-IFN-α，并在大腸桿菌 BL21（DE3）中獲得表達，對表達融合蛋白進行 SDS-PAGE和 Western-blot分析鑒定，將蛋白純化后免疫BALB/c小鼠，制備鼠抗延邊飼養(yǎng)鵝a干擾素成熟蛋白多克隆抗體，通過瓊脂糖擴散試驗經(jīng)行效價檢測。結果表明，擴增的鵝α干擾素基因全長576 bp，編碼192個氨基酸；成功構建了重組原核表達載體pET-30a-I

3、FN-α，表達的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot檢測，分子質量大小約為29 ku，并具有良好的反應原性；成功制備鼠抗鵝 a干擾素成熟蛋白多克隆抗體，瓊脂糖擴散試驗檢測效價為1:32。
　　為了研究表達延邊飼養(yǎng)鵝α干擾素基因重組活載體疫苗的抗病毒活性，本試驗通過RT-PCR技術擴增得到延邊飼養(yǎng)鵝α干擾素基因，利用基因重組技術構建了pSY681-LP2EP2- IFN-α-Lac轉移載體,采用脂質體轉染方法將該重組

4、質粒與禽痘病毒 FPV-017共轉染雞胚成纖維細胞（CEF），進行藍白斑篩選，收獲純化的重組病毒，并進行重組病毒α干擾素基因的PCR鑒定及重組病毒的間接免疫熒光(IFA)和Western blot檢測，通過細胞病變分析干擾素的抗病毒活性。結果顯示，成功制備了重組禽痘病毒rFPV-IFN-α，PCR結果顯示成功將延邊飼養(yǎng)鵝α干擾素基因亞克隆到禽痘病毒載體，間接免疫熒光和Western blot檢測表明延邊飼養(yǎng)鵝α干擾素基因在 CEF中成功