Runx2調(diào)控小鼠成牙本質(zhì)細胞與成釉細胞的分化以及牙齒礦化的研究.pdf

1、Runx2是一種在成骨細胞分化及牙齒的發(fā)育過程中起著重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，牙齒以及骨組織中的特異性基質(zhì)蛋白在轉(zhuǎn)錄水平均受其調(diào)控。Runx2缺陷導致包括牙齒在內(nèi)的全身硬組織疾病，如鎖骨顱骨發(fā)育異常（CCD）。Runx2基因敲除表現(xiàn)出嚴重的骨及牙齒發(fā)育障礙。結(jié)合Runx2的轉(zhuǎn)錄因子特性，以及在牙齒發(fā)育過程中的表達特征，可以推測Runx2可能也是牙齒發(fā)育和礦化的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。最近有研究發(fā)現(xiàn)，在牙胚發(fā)育過程中Runx2存在著表達的時空性，并且

2、證實Runx2可以調(diào)控牙齒發(fā)育中的某些特異性基質(zhì)蛋白的表達。同時，有結(jié)果顯示，釉原蛋白基因的啟動子（-1641、+92）和牙本質(zhì)涎磷蛋白基因的啟動子（-3950、-3106）上存在Runx2結(jié)合位點，Runx2可以通過該位點顯著上調(diào)這兩種基因的表達。目前，在細胞水平上已經(jīng)證實，Runx2調(diào)控著多種與礦化相關(guān)蛋白的表達，但在動物水平上，Runx2又是如何調(diào)控蛋白表達以及對礦化又有哪些影響呢？
　　因此，本課題通過轉(zhuǎn)基因手段分別建立在

3、成釉細胞與成牙本質(zhì)細胞中特異性過表達Runx2的小鼠模型，研究Runx2對分化晚期的成釉細胞與成本質(zhì)細胞分化的影響以及因此造成的牙釉質(zhì)與牙本質(zhì)礦化的表型改變。為此，我們的課題共分為兩部分：
　　第一部分構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠
　　我們分別構(gòu)建pBluescriptIIKS(+)-AmelogeninPromoter-Runx2和pBluescriptIIKS(+)-DSPPPromoter-Runx2質(zhì)粒載體。通過顯微注射，將線性化

4、的質(zhì)粒注入小鼠受精卵中，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠，并且設(shè)計特異性引物，利用PCR技術(shù)，鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠的基因整合和表達情況。通過qRT-PCR篩選表達高的鼠系進行表型的分析。
　　第二部分轉(zhuǎn)基因小鼠表型分析
　　實驗一DSPPPromoter-Runx2轉(zhuǎn)基因小鼠表型分析
　　在牙本質(zhì)形成的啟始階段，轉(zhuǎn)基因小鼠成牙本質(zhì)細胞完全喪失本身的高柱狀形態(tài)和極化方向，前期牙本質(zhì)和牙本質(zhì)小管結(jié)構(gòu)消失，牙本質(zhì)變薄呈均質(zhì)狀的骨基質(zhì)樣結(jié)構(gòu)，并且髓腔

5、中出現(xiàn)新生的骨樣結(jié)構(gòu)，表明Runx2抑制了成牙本質(zhì)細胞的最終分化成熟，并誘導處于分化晚期狀態(tài)的成牙本質(zhì)細胞向成骨細胞分化。同時，強烈抑制DSPP的表達和牙本質(zhì)的形成，形成類骨基質(zhì)樣組織替代正常的牙本質(zhì)。
　　實驗二AmelogeninPromoter-Runx2轉(zhuǎn)基因小鼠表型分析
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因小鼠成釉細胞失去原有的高柱狀形態(tài)和極化特征，釉基質(zhì)的形成受到抑制，釉基質(zhì)在成釉細胞分泌早期階段就已被阻斷，并且釉原蛋白表達下調(diào)