皮膚成纖維細胞修復原位凍融前交叉韌帶的可行性相關實驗研究.pdf

1、前交叉韌帶（Anterior Cruciate Ligament,ACL）是膝關節(jié)內(nèi)重要穩(wěn)定結構，對于維持膝關節(jié)穩(wěn)定具有極其重要的作用，一方面其本身對防止脛骨前移起主要作用，并有部分纖維參與防止脛骨過度后移和內(nèi)外旋轉。另外一個方面，前交叉韌帶通過與后交叉韌帶和膝關節(jié)周圍軟組織的協(xié)同作用來維持膝關節(jié)的穩(wěn)定。ACL損傷的發(fā)病率隨著現(xiàn)代競技體育及全民健身運動的發(fā)展而不斷上升，損傷后由于缺乏自我愈合能力，而會進一步引起膝關節(jié)不穩(wěn)并繼發(fā)關節(jié)炎等，

2、目前在臨床主要需用移植物在關節(jié)鏡下移植重建前交叉韌帶。各種移植物都有其局限性，組織工程技術為目前的各種器官移植技術提供了較好的移植物選擇前景，利用組織工程方法構建材料有望克服目前移植物的問題。種子細胞、生物材料和組織構建是組織工程的三個基本要素。種子細胞的選擇成為韌帶組織工程的研究課題之一。目前提出作為種子細胞的選擇有皮膚成纖維細胞（SF）、內(nèi)側副韌帶細胞（MCL）、前交叉韌帶細胞（ACL），跟腱細胞（AT）。有體外實驗表明在這四種細胞

3、中，SF在增殖能力及膠原分泌功能上都優(yōu)于MCL、ACL、AT細胞，是一種比較理想的ACL組織工程的種子細胞。本實驗使用DiI和BrdU兩種不同類型的標記物對皮膚成纖維細胞進行體內(nèi)外的標記示蹤，并將皮膚成纖維細胞復合纖維生物蛋白膠修復原位凍融的兔前交叉韌帶和未修復的凍融韌帶行對比，初步研究皮膚成纖維細胞作為種子細胞構建組織工程前交叉韌帶的可行性。證明皮膚成纖維細胞是構建組織工程前交叉韌帶較為理想的種子細胞，為組織工程化ACL的種子細胞提供

4、一種種子細胞來源。
　　第一部分：原位凍融前交叉韌帶損傷模型的建立
　　目的：為體內(nèi)修復ACL建立一種較為可靠的ACL損傷模型。
　　方法：首先使用液氮對兔ACL進行原位凍融，使用液氮冰凍1分鐘，再在關節(jié)腔內(nèi)注入室溫生理鹽水浸泡3分鐘，重復上述步驟3次。
　　結果：8周后取材，HE染色表明實施原位凍融的ACL內(nèi)幾乎無細胞核存在。天狼猩紅染色顯示原位凍融的ACLⅢ型膠原明顯增加，ACL發(fā)生嚴重的退行性變。
　

5、　結論：通過以上手術方法可以為體內(nèi)修復前交叉韌帶損傷提供較為可靠的動物模型。
　　第二部分：皮膚成纖維細胞體外分離培養(yǎng)和生物學特性研究
　　目的：了解皮膚成纖維細胞的體外分離培養(yǎng)方法及其生物學特性，為采用SF進行韌帶組織工程種子細胞的研究打下基礎。
　　方法：分別采用組織塊法、酶消化法分離培養(yǎng)SF，對不同代次SF細胞進行相差顯微鏡觀察、生長曲線測定。
　　結果：酶消化法分離培養(yǎng)細胞貼壁快，傳代五次后，細胞的生長速

6、度減慢。
　　結論：酶消化法分離培養(yǎng)SF細胞更適合于組織工程，SF細胞第一～第四代可作為構建組織工程化前交叉韌帶的種子細胞。
　　第三部分：BrdU和CM-DiI標記示蹤SF復合纖維蛋白膠修復ACL損傷的比較研究
　　目的：探索使用BrdU（5-溴脫氧尿嘧啶核苷）和CM-DiI（1，1’-雙十八烷-3，3，3’，3，-四甲基吲哚羰花青-高氯酸鹽）標記SF的條件，比較兩種標記方法效果及體內(nèi)示蹤的可行性。研究皮膚成纖維細胞

7、在關節(jié)腔內(nèi)的存活情況，以探索SF作為構建組織工程ACL種子細胞的可行性。
　　方法：體外分離家兔自體SF，使用熒光染料CM－DiI對細胞進行標記，使用熒光倒置顯微鏡觀察0，24，48，72h細胞熒光強度及形態(tài)變化，MTT比色法測定標記前，后皮膚成纖維細胞的增殖狀況。使用BrdU標記SF，并在標記后行細胞爬片的免疫組化染色，同樣使用MTT比色法測定標記前，后皮膚成纖維細胞的增殖狀況。分別標記后與纖維蛋白膠復合，植入原位凍融的ACL的

8、關節(jié)腔內(nèi)，并包裹在ACL周圍。12周后取材，行HE染色及免疫組化染色。
　　結果：DiI及BrdU標記SF的標記率良好，SF在使用DiI以及BrdU標記前后生長無區(qū)別。DiI標記后早期細胞形態(tài)呈熒光環(huán)狀，48h后細胞中熒光顆粒增多，熒光增強，細胞核未染熒光，在72h無明顯變化。體內(nèi)實驗結果，HE染色表現(xiàn)韌帶周邊有較多成纖維細胞聚集，周邊膠原纖維走行較好，而內(nèi)部發(fā)生嚴重的玻璃樣改變。由于在熒光顯微鏡下，膠原纖維在熒光激發(fā)下發(fā)光，Di

9、I顯色與背景色較難區(qū)分，而免疫組化染色顯示包裹在韌帶周圍的蛋白膠中有大量陽性染色團塊存在。
　　結論：使用DiI等一類熒光標記物在體內(nèi)示蹤方面劣勢較BrdU明顯，故BrdU在本實驗研究中示蹤效果優(yōu)于DiI。皮膚成纖維細胞在關節(jié)腔內(nèi)可以存活，可能是一種較為可行的種子細胞來源。
　　通過以上三部分研究，明確了SF體外分離培養(yǎng)方法，了解了其體外生物學特征，探索出較為可靠的體內(nèi)標記示蹤手段，皮膚成纖維細胞在凍融后的前交叉韌帶可以存活