Tet-on系統(tǒng)誘導表達人突變A30Pα-synuclein小鼠的相關研究.pdf

1、本文主要從以下幾個方面展開： 第一部分： Tet-on系統(tǒng)誘導表達人突變A30P α-synuclein轉基因小鼠的構建 目的：構建Tet-on系統(tǒng)誘導表達人突變A30P α-synuclein轉基因小鼠。 方法：通過RT-PCR方法從人胎腦中克隆野生型SNCA基因,T-A克隆并測序，并利用單核苷酸差異引物定點誘變構建致病突變Ala30Pro的SNCA基因，采用雙酶切法構建含Ala30Pro致病突變基因的pTRE

2、2-syn載體，酶切鑒定，并測序。利用Tet-on系統(tǒng)，采用顯微注射法，同時將pTRE2-syn目的基因和pBC-rtTA調(diào)控基因注入FVB小鼠受精卵的雄原核中，注射受精卵移植到同期發(fā)情的假孕受體出生個體，取21日齡的斷乳小鼠剪尾法提取DNA，經(jīng)PCR檢測獲得陽性轉基因小鼠，基因測序驗證A30P的突變位點。 結果：電泳結果顯示RT-PCR方法成功克隆了SNCA基因的cDNA序列，目的基因為481bp；含致病突變Ala30Pro的

3、SNCA基因的pTRE2-syn載體經(jīng)Bam HI和HindⅢ雙酶切鑒定正確，測序結果也顯示編碼α-突觸核蛋白第30位氨基酸的密碼子由GCA突變?yōu)镃CA,其相應編碼的氨基酸由Ala突變?yōu)镻ro；經(jīng)PCR檢測檢測共得到rtTA和A30P突變型α-synuclein雙陽性轉基因F0代小鼠1只，A30P突變型α-synuclein單陽性轉基因F0代小鼠13只。 結論：成功構建了受強力霉素調(diào)控的高表達A30P突變型α-synuclein

4、 Tet-On轉基因小鼠。 第二部分：人突變A30Pα-synuclein轉基因小鼠行為學特性的研究 目的：通過強力霉素(DOX)誘導，使人突變A30P α-synuclein基因大量表達，觀察突變基因表達后小鼠運動功能的行為學變化。 方法：雙陽性轉基因FVB小鼠，每組15只，并設雙陰性對照組15只，均于強力霉素1.5mg/ml飲水誘導。分別在誘導2周、誘導4周和誘導8周時對各組動物的行為學指標進行動態(tài)觀察。小鼠

5、轉棒儀測定小鼠轉棒潛伏期；小鼠自發(fā)活動箱測定小鼠自發(fā)活動量；自制小鼠爬桿測定爬桿時間。 結果：誘導2周組與雙陰性對照之間的自發(fā)活動、轉棒潛伏期及爬桿時間沒有統(tǒng)計學意義；誘導滿4周后小鼠的自發(fā)活動、轉棒潛伏期比陰性對照要明顯減少，爬桿時間明顯增加(p<0.01)；誘導滿8周的小鼠自發(fā)活動最少，轉棒潛伏期最短，而相應的爬桿時間最長。 結論:強力霉素誘導對轉基因小鼠的運動功能存在顯著影響。誘導4周的時候較為明顯，并在4周后隨著

6、誘導時間的延長出現(xiàn)癥狀越來越重。 第三部分：人突變A30P α-syunclein轉基因小鼠PD模型的建立與初步鑒定 目的：轉基因FVB小鼠誘導后出現(xiàn)運動功能的變化，誘導4周后運動功能明顯衰退，為探討這一現(xiàn)象，進一步觀察突變α-synuclein表達情況以及相應的解剖病理基礎。 方法：雙陽性轉基因FVB小鼠，每組15只，并設雙陰性對照組15只，均于強力霉素1.5mg／ml飲水誘導。分別以Western-blott

7、ing和RT-PCR法檢測誘導2周、4周和8周時α-synuclein蛋白表達及mRNA水平。小鼠黑質連續(xù)切片，酪氨酸羥化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)免疫組織化學染色并觀察TH陽性細胞數(shù)的變化。 結果:強力霉素誘導后，α-synuclein在小鼠的小腦、腦干、海馬、皮層均有表達，海馬、皮層表達更多，誘導滿4周后，腦干α-synuclein表達明顯增加，8周后增加更明顯。轉基因小鼠α-synucleinRN