骨髓間充質(zhì)干細胞復(fù)合“雙相”骨基質(zhì)明膠體外構(gòu)建骨軟骨復(fù)合物.pdf

1、目的：探討利用兔骨髓間充質(zhì)干細胞（MSC）在支架材料骨基質(zhì)明膠（BMG）上體外培養(yǎng)構(gòu)建骨軟骨復(fù)合物的可能性。 方法：實驗于2008．06-2009．01在大連醫(yī)科大學附屬二院實驗中心完成。 ①2-3月齡日本大耳兔，體重2．5-3．5kg，雌雄不限，無菌條件下骨髓穿刺針取股骨骨髓，采用密度梯度離心法和貼壁篩選法分離純化骨髓間充質(zhì)干細胞，傳代倍增后，取第3．4代生長狀態(tài)良好的間充質(zhì)干細胞，在特定的軟骨誘導劑（HG-DMEM中

2、加入地塞米松、維生素C、TGF-β1、ITS-3146）和成骨誘導劑（15%FBS+LG-DMEM中加入地塞米松、維生素C、β-甘油磷酸鈉）下定向誘導骨髓間充質(zhì)干細胞。 ②制備一側(cè)全脫鈣，一側(cè)未脫鈣的“雙相”BMG支架載體。 ③將誘導后具有成骨細胞和軟骨細胞相應(yīng)表型的MSC分別移植到事先處理好的“雙相”支架載體上繼續(xù)培養(yǎng)，分別在1w，3w行Masson染色、堿性磷酸酶（ALP）染色，Ⅱ型膠原蛋白免疫組化染色。 結(jié)

3、果：①倒置相差顯微鏡觀察MSC原代細胞生長緩慢，呈短梭形，1-3w可達70-80%融合，傳代細胞48h內(nèi)增殖緩慢，3d后細胞增殖旺盛，7-8d進入平臺期，第3．4代增殖最為旺盛，成骨誘導后細胞形態(tài)由長梭型變?yōu)槎噙呅?，立方形，三角形。軟骨誘導后的MSC細胞呈橢圓形或圓形。 ②制備的同種異體骨基質(zhì)明膠（BMG）為三維多孔海綿狀結(jié)構(gòu)，可塑性好，有彈性，并有適宜的強度，未脫鈣的一側(cè)強度較高，脫鈣的一側(cè)強度較對側(cè)低。 ③Masso

4、n染色：培養(yǎng)21d，可見成骨誘導側(cè)顯示藍色表達，軟骨誘導側(cè)現(xiàn)實紅色表達。 ALP染色：培養(yǎng)7d，ALP染色不明顯，未形成鈣結(jié)節(jié)，培養(yǎng)21d可見成骨細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量棕黑色顆粒，對照組未見著色。 Ⅱ型膠原免疫組化染色：培養(yǎng)21d后見切片軟骨細胞側(cè)胞漿內(nèi)棕黃色表達，Ⅱ型膠原免疫組化染色為陽性。 結(jié)論：一側(cè)全脫鈣，一側(cè)未脫鈣的異體BMG可做為組織工程支架材料，可以結(jié)合自體MSC誘導的成骨和軟骨前體細胞在體外制備組織工