熱應激對雄鼠生殖機能損傷的研究.pdf

1、以昆明雄性小白鼠為受試動物，分別用近似陰囊溫度(33℃)、腹溫(37℃)和超高溫(42℃)三個溫度組，實施1h/d的應激處理，以建立持續(xù)的全身熱應激動物模型。以小鼠精子發(fā)生過程各階段所需時間確定熱應激持續(xù)的時間，每個溫度組又分別設四個不同熱應激持續(xù)時間(8d、13d、21d和35d)。在熱應激處理的過程中記錄小鼠應激前后體重和肛溫的變化。分別在熱應激持續(xù)到8d、13d、21d和35d時，應用形態(tài)學觀察法，研究受試鼠睪丸和附睪重量及指數(shù)、

2、組織結構、細胞凋亡和附睪精子形態(tài)學的變化；應用免疫熒光細胞化學和蛋白質印跡分析的方法，研究睪丸和附睪組織中熱休克蛋白70(HSP70)的表達；應用比色法檢測睪丸和附睪組織內(nèi)活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)、抗氧化物酶(SOD、GSH-Px、CAT)的活力或濃度的變化；應用交配試驗，檢測雄鼠受精能力及其致孕雌鼠的產(chǎn)仔數(shù)的變化，用以揭示熱應激對雄鼠生殖機能的影響。試驗結果如下： 1.熱應激前后的鼠體重和肛溫變化 體重的變化

3、：受熱應激前和后，鼠體重減輕，并且是熱應激后的體重低于熱應激前的體重。而受熱應激前和后的鼠體重的差值變化是熱應激溫度越高其越大，熱應激次數(shù)越多其越小。 肛溫的變化：受熱應激后，鼠肛溫上升，并且是熱應激溫度越高，上升的幅度越明顯，但隨熱應激次數(shù)的增加變化不顯著；而每次受熱應激前，鼠肛溫恢復到對照組的水平。 2.熱應激鼠體重、睪丸和附睪重量及其重量指數(shù)的變化 受熱應激后，與對照組相比，鼠的體重、睪丸和附睪重下降，并且

4、熱應激溫度越高越明顯。除37℃組和33℃組分別應激8d和13d外的各組，應激后的鼠體重均顯著(P＜0.05)低于對照組；除33℃組分別應激13d和21d、37℃組應激13d外的各組，應激后的鼠睪丸重量均顯著(P＜0.05)低于對照組；除33℃組和37℃組應激8d外的各組，應激后的鼠附睪重量均顯著(P＜0.05)低于對照組。 除42℃應激后的鼠睪丸重量指數(shù)顯著(P＜0.05)小于對照組外，其它各組的鼠睪丸重量指數(shù)與對照組間均無顯著

5、差異(P＞0.05)。而受熱應激后，各應激組的鼠附睪重量指數(shù)與對照組間均無顯著差異(P＞0.05)。 3.熱應激鼠附睪尾精子的形態(tài)學變化 受熱應激后，鼠附睪尾精子密度和精子頂體完整率呈下降趨勢，并低于對照組。除33℃組分別應激8d、13d后的精子密度與對照組間無顯著差異(P＞0.05)外，其它各組均顯著(P＜0.05)低于對照組。除33℃應激后的精子頂體完整率與對照組間無顯著差異(P＞0.05)外，其它各組均顯著(P＜0

6、.05)低于對照組。 受熱應激后，鼠附睪尾精子畸形率呈現(xiàn)升高趨勢，并高于對照組。除37℃組應激8d、33℃組分別應激8d、13d、21d后的精子畸形率與對照組無顯著差異(P＞0.05)外，其它各組均顯著(P＜0.05)高于對照組。 4.熱應激鼠睪丸和附睪組織病理學變化及細胞凋亡 睪丸和附睪組織病理學變化：42℃應激處理8d、13d后，睪丸間質增生，偶見炎性細胞浸潤，毛細血管充血；精曲細管松散，上皮排列基本不變，但

7、可見精原細胞胞質出現(xiàn)空泡，腔內(nèi)精子減少。42℃應激處理21d、35d后，睪丸間質細胞減少，毛細血管極度擴張；精曲細管松散，管腔增大，生精上皮變薄，不完整，細胞數(shù)量明顯減少，細胞排列疏松、無序，部分生精細胞從生精上皮脫落進入曲細精管管腔，生成的精子數(shù)量減少。37℃應激處理8d、13d后，睪丸組織形態(tài)學無明顯變化，熱應激處理21d后，睪丸間質毛細血管充血，偶見曲細精管基膜破裂。熱應激處理35d后，曲細精管間距明顯加大，間質細胞增大；生精上皮

8、細胞排列松散，有序排列被破壞。33℃應激處理8d、13d和21d后，睪丸組織形態(tài)學無明顯變化，而熱應激處理35d后，曲細精管間距加大，生精細胞排列基本有序。42℃應激處理的鼠附睪組織，隨著熱應激持續(xù)時間的延長，附睪頭部管周結締組織減少，管間間隙變大，腔內(nèi)精子減少；附睪體部的附睪管上皮細胞逐漸稀少、排列疏松，熱應激處理35d后，附睪管壁出現(xiàn)缺損；附睪尾部的附睪管上皮細胞逐漸稀少、排列疏松，管間結締組織減少。37℃和33℃應激處理組，鼠附睪

9、無明顯的組織學變化。 睪丸和附睪組織細胞凋亡：42℃應激處理8d后，鼠睪丸組織切片觀察到明顯的細胞凋亡信號，凋亡主要發(fā)生在精原細胞。42℃應激處理13d、21d和35d后，鼠睪丸組織凋亡信號逐漸減弱，并伴隨大量生精細胞的丟失。37℃和33℃應激處理組，鼠的睪丸組織沒有明顯細胞凋亡信號。42℃應激處理13d后，鼠附睪組織切片出現(xiàn)明顯的細胞凋亡信號，主要發(fā)生在附睪體和尾部的附睪管上皮細胞，管腔內(nèi)可見凋亡小體，而熱應激處理21d和35

10、d后，凋亡信號減弱，并伴有附睪上皮脫落入管腔。37℃和33℃應激處理組，鼠附睪組織沒有明顯細胞凋亡信號。 5.熱應激鼠睪丸和附睪內(nèi)HSP70的表達 睪丸組織HSP70表達：對照組的鼠睪丸組織中HSP70呈極強表達(+++)；42℃應激處理8d后的鼠睪丸組織HSP70呈弱表達(+)，主要在精母細胞、精子細胞和支持細胞內(nèi)表達；熱應激處理13d和21d后的鼠睪丸組織呈極弱表達(±)；熱應激處理35d后的鼠睪丸組織HSP70呈弱

11、表達(+)；37℃和33℃應激處理組的鼠睪丸組織HSP70呈強陽性表達(++)，與熱應激處理時間的長短無關。Westernblot檢測結果與免疫組織化學結果一致。 附睪組織HSP70表達：對照組的鼠附睪組織中HSP70呈極強表達(+++)；42(應激處理8d后的鼠附睪組織HSP70呈強陽性表達(++)，熱應激處理13d和21d后的鼠附睪組織HSP70呈弱表達(+)，熱應激處理35d后的鼠附睪組織HSP70呈極弱表達(±)；37℃

12、和33℃應激處理組的鼠附睪組織HSP70呈極強或強陽性表達(+++或++)，并且其表達與熱應激處理時間的長短無關。Westernblot檢測結果與免疫組織化學結果一致。 6.熱應激鼠睪丸和附睪組織ROS活力和MDA濃度變化 受熱應激后，鼠睪丸和附睪組織ROS活力和MDA濃度呈現(xiàn)升高趨勢，并且均高于對照組。對照組的鼠睪丸和附睪組織ROS活力和MDA濃度保持穩(wěn)定。42℃和37℃應激處理的鼠睪丸和附睪組織ROS活力和MDA濃度

13、均顯著(P＜0.05)高于對照組；33℃應激處理的鼠睪丸和附睪組織ROS活力和MDA濃度，除熱應激處理35d后的與對照組間無顯著差異(P＞0.05)外，其它各組均顯著(P＜0.05)高于對照組。 7.熱應激鼠睪丸和附睪組織SOD、GSH-Px和CAT活力變化 42℃和37℃組的鼠睪丸和附睪組織SOD、GSH-Px和CAT活力呈現(xiàn)升高趨勢，而33℃組則下降。對照組的鼠睪丸和附睪組織SOD、GSH-Px和CAT活力均保持穩(wěn)定

14、。 42℃組的鼠睪丸和附睪組織SOD活力均顯著(P＜0.05)低于對照組；37℃組的鼠睪丸和附睪組織SOD活力，在熱應激處理8d后均顯著(P＜0.05)低于對照組，在熱應激處理13d后與對照組無顯著差異(P＞0.05)，在21d和35d后均顯著(P＜0.05)高于對照組；33℃組的鼠睪丸和附睪組織SOD活力，除在熱應激處理35d后的鼠附睪組織與對照組間無顯著差異外，其它各組均顯著高于(P＜0.05)對照組。 42℃組的鼠

15、睪丸和附睪組織GSH-Px活力均低于對照組，睪丸組織GSH-Px活力在熱應激處理8d和13d后顯著低于(P＜0.05)對照組，在熱應激處理21d和35d后與對照組間無顯著差異(P＞0.05)，而附睪組織GSH-Px活力除熱應激處理8d后顯著(P＜0.05)低于對照組外，其它各組與對照組間無顯著差異(P＞0.05)；37℃組的鼠睪丸組織GSH-Px活力與對照組間無顯著差異(P＞0.05)，而附睪組織GSH-Px活力除在熱應激處理35d后顯

16、著(P＜0.05)高于對照組外，其它各組與對照組間無顯著差異(P＞0.05)；33℃組的鼠睪丸組織GSH-Px活力與對照組間無顯著差異(P＞0.05)，而附睪組織GSH-Px活力除在熱應激處理8d后顯著(P＜0.05)高于對照組外，其它各組與對照組間均無顯著差異(P＞0.05)。 42℃組的鼠睪丸和附睪組織CAT活力均低于對照組，除熱應激處理35d后的鼠附睪組織CAT活力與對照組間無顯著差異外，其它各組鼠睪丸和附睪組織CAT活力

17、均顯著(P＜0.05)低于對照組；37℃組除熱應激處理8d后的鼠睪丸和附睪組織CAT活力與對照組無顯著差異外(P＞0.05)，其它各組鼠的睪丸和附睪組織CAT活力均顯著(P＜0.05)高于對照組；33℃組的鼠睪丸和附睪組織CAT活力均顯著(P＜0.05)高于對照組。 8.熱應激后雄鼠生育能力的變化 隨著熱應激持續(xù)時間的延長，33℃和37℃組的鼠受精率提高，但明顯低于對照組；42℃組的鼠受精能力一直處于較低水平。熱應激雄鼠