精原細胞介導的血管生成素樣蛋白3表達變化對小鼠腎臟結構和功能的影響.pdf

1、足細胞裂孔隔膜蛋白分子是腎小球濾過屏障結構和功能的重要組成部分,研究證實,nephrin、podocin、synaptopodin等足細胞蛋白分子與蛋白尿形成密切相關,成為闡明原發(fā)性腎病綜合征發(fā)病機制和研發(fā)藥物靶點的熱點。本課題組前期采用基因芯片技術對原發(fā)性微小病變型(MCD)腎病綜合征患兒的腎組織基因表達譜進行分析篩選,發(fā)現患兒腎組織中血管生成素樣蛋白3(ANGPTL3)表達水平明顯升高,隨后在阿霉素大鼠模型中也發(fā)現了類似的情況。進一

2、步的體外實驗發(fā)現,ANGPTL3可影響足細胞與基底膜(GBM)的黏附穩(wěn)定,還能夠引發(fā)足細胞骨架重排。以上提示ANGPTL3可能是影響足細胞裂孔隔膜結構和功能的重要因子之一。
　　ANGPTL3是血管生成素家族的成員之一,分子量70KDa(人),主要由肝細胞合成,在正常狀態(tài)下腎組織僅有微量表達。其生物學功能有促進血管生成和調節(jié)脂質代謝,以往對于ANGPTL3的研究主要集中于脂質代謝,研究發(fā)現它可以通過抑制脂酶活性,導致血脂升高,尤以

3、甘油三酯和低密度脂蛋白為主。近期研究發(fā)現,ANGPTL3可以通過和血管內皮整合素β3受體結合來發(fā)揮其調節(jié)血管生成的生物學作用,整合素β3成為ANGPTL3的主要受體。本課題組前期的體外研究也發(fā)現ANGPTL3可以在腎小球足細胞中與整合素β3存在共定位關系,并通過激活下游信號轉導通路導致足細胞骨架重排,表明整合素β3是ANGPTL3在腎臟的重要下游受體;進一步研究還發(fā)現ANGPTL3低表達可保護足細胞骨架結構在阿霉素損傷時的相對完整性。我

4、們前期的研究充分的提示ANGPTL3與腎病時足細胞功能和蛋白尿的變化有密切的關系,但尚需整體水平上進一步深入研究,即通過ANGPTL3表達改變的動物模型來考察ANGPTL3對腎臟結構和功能的影響。
　　體內精原細胞介導制備轉基因動物的方法較傳統方法獲得轉基因子代周期短,制作過程簡單,不需要特殊的儀器。據報道,通過這種方法,F0代精子中目的基因穩(wěn)定表達長達一年余,第一代轉基因仔鼠可以在手術后60天左右可以獲得,鑒定陽性率可高達60％

5、。本課題擬通過精原細胞介導的轉基因技術制備ANGPTL3表達上調和下調小鼠模型,考察ANGPTL3表達變化對小鼠腎臟功能及足細胞的影響;進一步在ANGPTL3表達上調和下調轉基因小鼠模型的基礎上,制備阿霉素腎病小鼠模型,觀察ANGPTL3表達變化在阿霉素作用下對小鼠腎臟功能及足細胞結構的影響,深入探討ANGPTL3對腎臟產生影響的可能機制,為腎病綜合征發(fā)病機制的研究及治療靶點的研發(fā)提供堅實的基礎研究依據。
　　第一部分ANGPTL

6、3表達變化的轉基因小鼠模型的制備與鑒定及其對腎臟的影響
　　目的通過精原細胞介導的動物轉基因技術制備ANGPTL3表達上調和下調的小鼠模型,了解ANGPTL3對小鼠腎臟功能及足細胞結構的影響,建立簡易有效的動物轉基因技術平臺。方法(1)制備和線性化ANGPTL3重組質粒pcDNA3.1-ANGPTL3和小干擾質粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-ANGPTL3-miRNA;各取4周齡Balb/C雄性小鼠20只和昆明系(KM)雄性

7、小鼠10只,分別將這二種線性化質粒20ul(0.5ug/ul)注射入右側睪丸內,電穿孔后復位,同時結扎摘除左側睪丸(F0代);(2)分別于術后1、3、6和12月取2只注射pcDNA6.2-GW/EmGFP.ANGPTL3-miRNA質粒的Balb/C雄鼠的睪丸,觀察睪丸轉染綠色熒光蛋白(GFP)表達情況,了解FO代小鼠睪丸中目的質粒轉染的情況;(3)術后35天分別與野生型雌鼠合籠交配,所產子代(F1代)以特異性引物PCR鑒定其基因型后,

8、分為3組:ANGPTL3上調組(AT,ANGPTL3transgenetic)、ANGPTL3干擾組(AR,ANGPTL3RNAi)和野生型組(WT,wild-type)。每組各取5只6周齡小鼠,ELISA法檢測血清中ANGPTL3水平,通過Real-timePCR、免疫組化、Westernblot檢測肝臟和腎皮質ANGPTL3表達,以腎臟表達情況驗證ANGPTL3上調和干擾效率;觀察各組間小鼠表型變化;(4)檢測24小時尿蛋白定量和血

9、脂(甘油三酯和膽固醇)水平,觀察腎小球結構形態(tài);TUNEL法檢測腎小球細胞凋亡情況;Real-timePCR、免疫組化和Westernblot檢測腎皮質中integirn-β3、nephrin、podocin、WT1、VEGF、LXR和synaptopdin的表達。
　　結果(1)雄鼠睪丸注射及電穿孔手術成功率100％,術后雄鼠在適宜環(huán)境下一月內全部恢復正常狀態(tài);FO代Balb/C雄鼠術后1、3、6月,睪丸中仍表達GFP,3月時表

10、達最強,但有逐漸減弱的趨勢,術后12月消失;Balb/C和KMF0代小鼠術后各有11只(55.O％)和10只(100％)產有子代;(2)基因組PCR鑒定Fl代子鼠共298只,陽性小鼠134只(44.9％),其中AT組50.O％(66/132),AR組40.9％(68/166);Balb/C和KMF1代小鼠PCR鑒定陽性率分別為40.0％和60.3％;AR組和AT組小鼠在外觀、活動、性格等方面無明顯差異;(3)小鼠血清中ANGPTL3水平

11、:Balb/C小鼠中,AT組(32.5±2.0ug/ml)明顯高于AR組(20.2±2.1ug/ml)和WT組(25.2±1.7ug/ml),AR組明顯低于WT組(均P＜0.05);KM系小鼠中,AT組(40.4±2.2ug/ml)明顯高于AR組(34.5±4.5ug/ml)(P=0.038),但與WT組(39.5±4.0ug/ml)無明顯差異;Balb/C小鼠中肝臟和腎皮質ANGPTL3表達及mRNA水平:AT組>WT組>AR組,其中

12、AT組明顯高于AR組(均P＜0.05)。以腎小球中ANGPTL3的表達變化為標準,AT組小鼠ANGPTL3上調的效率約為65.5％,AR組小鼠ANGPTL3下調的效率約為31.2％;(4)Balb/C小鼠血清甘油三酯水平:AT組>WT組>mR組,AT組明顯高于AR組(P=0.040);膽固醇三組間無明顯變化;AT組體重明顯低于AR組和WT組(P＜0.001);Balb/C小鼠24小時尿蛋白定量、腎小球形態(tài)學和細胞凋亡水平三組間無明顯差異

13、;Balb/C小鼠腎皮質整合素β3、podocin、synaptopdin和VEGF表達及mRNA水平:AT組>WT組>AR組;而nephrin則相反,AR組>WT組>AT組;LXR和WT1表達在各組間無明顯差異。
　　小結成功地以體內精原細胞介導的轉基因技術建立ANGPTL3表達上調與下調轉基因小鼠模型,上調效率約為65.5％,下調效率約為31.2％。該方法制備轉基因動物的子代陽性率為44.9％;ANGPTL3上調可引起血清甘油

14、三酯水平升高,體重下降。同時ANGPTL3表達的變化可引起足細胞分子整合素β3、podocin、synaptopdin、VEGF和nephrin表達的變化。
　　第二部分體內ANGPTL3表達改變對阿霉素腎病小鼠腎臟結構和功能的影響及其機制
　　目的觀察ANGPTL3表達上調和下調對阿霉素作用下小鼠腎臟功能的影響,探討ANGPTL3對腎臟結構和功能產生影響的可能機制。
　　方法(1)于AT組(ANGPTL3表達上調效率

15、為65.5％,見第一部分)、WT組和AR組(ANGPTL3表達下調效率為31.2％,見第一部分)各取6周齡Balb/C雄鼠7只,尾靜脈注射阿霉素10.5mg/kg,分別命名為:A-AT、A-WT。和A-AR;對照組注射同等劑量生理鹽水,分別命名為:AT、AR和WT。分別于第1、2、4、6周收取24小時尿液,第6周處死,留取血清和腎臟標本;(2)檢測指標和方法同第二部分。
　　結果(1)阿霉素注射后,三組小鼠24小時尿蛋白于第2周開

16、始升高,其中,第2周時A-AR組低于A-WT組;第2周和第6周時A-AT組明顯高于A-AR組(P=0.026和0.035);第6周時血清甘油三酯水平阿霉素組均明顯高于對照組,其中A-AT組明顯高于A-AR組(P=0.028);膽固醇水平:在阿霉素組較對照組升高,其中A-AT組較AT組顯著升高(P=0.039),在阿霉素組內A-AT組較A-AR.組和A-WT組升高,A-AR組低于A-WT組;(2)電鏡下阿霉素注射三組小鼠均出現大量腎小球足

17、突融合,其中,A-AT組較A-AR組和A-WT組小鼠足突融合更廣泛,而A-AR組較A-WT組足突融合程度輕;(3)TUNEL顯示阿霉素注射三組小鼠腎小球細胞凋亡均升高,其中A-AT組明顯高于A-AR組和A-WT組;(4)血清中ANGPTL3水平A-AT組較A-AR組、A-WT組和AT組均明顯升高(P=0.038和0.011);腎皮質中ANGPTL3表達和mRNA水平A-AT組較A-WT組升高,A-AR組較A-WT組降低;(5)腎皮質整合

18、素β3、synaptopdin和VEGF表達及mRNA水平A-AT組較A-AR組和A-WT組顯著升高,而nephrin和WT1則顯著降低,LXR在三組間無明顯差異。
　　小結ANGPTL3表達上調65％可使阿霉素腎病小鼠蛋白尿顯著升高,腎臟損傷更加嚴重;可使阿霉素腎病小鼠甘油三酯和膽固醇水平升高更顯著;可促進阿霉素作用下腎小球細胞凋亡水平,可誘導更顯著的腎小球Synaptopdin、VEGF、整合素β3表達升高,以及nephrin

19、與WT1表達降低;ANGPTL3表達下調31.2％較野生型小鼠在阿霉素作用下尿蛋白的發(fā)生延遲,可以減輕因阿霉素損傷引起的足突融合;在腎臟結構及足細胞蛋白分子表達等各方面無明顯差異。
　　結論
　　1.精原細胞介導的動物轉基因技術較傳統的轉基因及基因敲除技術簡便經濟,易于操作。FO代雄鼠睪丸電轉質粒后可穩(wěn)定表達6個月;F1代轉基因小鼠陽性率約為45％;生殖能力及子代的轉基因鼠陽性率與動物品系的不同有關,KM鼠高于Balb/C小

20、鼠;AT組小鼠ANGPTL3表達上調的效率約為65.5％,AR組小鼠ANGPTL3表達下調的效率約為31.2％。
　　2.ANGPTL3表達上調可引起小鼠甘油三酯升高,體重下降,引起腎臟足細胞蛋白分子整合素β3、podocin、synaptopdin、VEGF、nephrin等發(fā)生變化;ANGPTL3表達下調可使小鼠甘油三酯降低,足細胞各分子的變化與ANGPTL3表達上調時相反。
　　3.在阿霉素作用下,ANGPTL3表達上

21、調可使血清甘油三酯和膽固醇水平明顯升高,并引起更嚴重的腎臟足細胞的損傷,血脂、腎小球細胞凋亡水平及VEGF、整合素β3等升高更明顯,并且導致nephrin與WT1表達下降更顯著。
　　4.在阿霉素作用下,ANGPTL3表達下調31.2％較野生型小鼠尿蛋白發(fā)生延遲,血清膽固醇略低,可以保護足細胞的完整性,減輕因阿霉素損傷引起的足突融合;但腎臟足細胞各蛋白分子間,如整合素β3、podocin、synaptopdin、VEGF、neph