柞蠶絲素作為VEGF165-Ang-1雙基因共表達質(zhì)粒傳遞載體的研究.pdf

1、工程化組織的血管再生問題是組織工程面臨的關(guān)鍵挑戰(zhàn)。在三維支架內(nèi)復合促進血管再生的生長因子基因是解決這一問題的重要途徑。VEGF(主要是VEGF165)和Ang(主要是Ang-1)是兩種最重要的且僅以血管內(nèi)皮細胞為靶細胞的促血管再生生長因子,在新血管的形成中扮演著關(guān)鍵的角色,但它們在體內(nèi)易被代謝、失活,半衰期短。若能采用適當?shù)幕騻鬟f載體裝載外源性VEGF和Ang基因,并裝載到三維支架上,生長因子能穩(wěn)定、持續(xù)、高效地轉(zhuǎn)染周圍細胞并持續(xù)表達

2、、分泌相關(guān)的生長因子,則能克服在支架內(nèi)直接復合生長因子半衰期短的缺陷。而在基因傳遞系統(tǒng)中,基因傳遞載體對轉(zhuǎn)染效率起決定性作用。PEI作為非病毒載體的典型代表,具有質(zhì)子海綿效應,轉(zhuǎn)染效率較高。但PEI所帶正電荷的密度很高,細胞毒性較大,且不能被生物降解。柞蠶絲素是一種具有良好細胞相容性、生物活性和可降解性的蛋白質(zhì),且含RGD序列,可以通過受體介導作用特異性粘附細胞,并可能進而被細胞內(nèi)吞。帶負電荷的柞蠶絲素可以與帶正電荷的PEI復合作為pD

3、NA的傳遞載體,共同包被VEGF165和Ang-1雙基因共表達質(zhì)粒,降低PEI的細胞毒性,提高轉(zhuǎn)染效率。
　　本文研究柞蠶絲素蛋白和PEI共同作為VEGF165和Ang-1雙基因共表達質(zhì)粒(用GFP作為報告基因)的傳遞載體對EA.hy926細胞的轉(zhuǎn)染效率及細胞毒性的影響,尋找最佳的復合物制備方案,并將ASF/PEI/DNA復合物裝載到絲素蛋白多孔支架上考察其對EA.hy926細胞的體外轉(zhuǎn)染效率,以及在雞胚絨毛尿囊膜(CAM)模型中

4、對血管形成的促進作用。
　　首先,初步探討了ASF/PEI/DNA轉(zhuǎn)染EA.hy926細胞的效率。用ASF/PEI/DNA復合物轉(zhuǎn)染EA.hy926細胞并進行激光共聚焦觀察和流式細胞儀GFP陽性細胞比率檢測。結(jié)果表明, ASF/PEI/DNA(60/3/2)組明顯地比 ASF/PEI/DNA(30/3/2)組和ASF/PEI/DNA(90/3/2)組轉(zhuǎn)染效率高,但比ASF/PEI/DNA(120/3/2)組低。
　　然后,研

5、究了ASF/PEI/DNA三者比例對細胞轉(zhuǎn)染及細胞毒性的影響,尋找最佳的復合物制備方案。結(jié)果表明,當PEI/DNA質(zhì)量比為10μg/2μg時,ASF/PEI/DNA復合物中加大ASF所占的質(zhì)量比對轉(zhuǎn)染效率的影響較小。MTT法檢測PEI/DNA不同質(zhì)量比對EA.hy926細胞毒性的影響,結(jié)果表明,當PEI與DNA的相對質(zhì)量比分別為3/2,5/1,3/1時,隨著絕對質(zhì)量的增加,細胞存活率下降,細胞毒性增大。不同濃度ASF溶液以及不同質(zhì)量比的

6、ASF/PEI/DNA對EA.hy926細胞毒性影響的MTT測試結(jié)果表明,當ASF的濃度為5μg/μL時,ASF/PEI/DNA(60/10/2)的細胞存活率較高。用流式細胞儀定量檢測GFP陽性細胞比率結(jié)果表明,當ASF/PEI/DNA的質(zhì)量比為60/3/2時,轉(zhuǎn)染效率相對較高。
　　最后,在絲素支架內(nèi)裝載ASF/PEI/DNA(60/10/2)復合物研究其體外轉(zhuǎn)染效果。用CM-DiL和SEM觀察二維培養(yǎng)細胞在支架內(nèi)的分布情況;用

7、DAPI染核和CM-DiL活細胞染色劑觀察三維培養(yǎng)細胞在支架中的粘附生長情況。結(jié)果顯示,二維培養(yǎng)條件下,在材料的內(nèi)部和表面均可觀察到大量的細胞,且細胞在支架中能比較充分地鋪展;三維培養(yǎng)細胞至3d時細胞數(shù)量比1d時少了,但在隨后7、9和14d時細胞數(shù)量呈明顯的增多趨勢。將包裹含GFP報告基因的質(zhì)粒DNA的復合物裝載到支架上轉(zhuǎn)染細胞,結(jié)果在支架中可以觀察到發(fā)熒光的細胞。ASF/PEI/DNA(60/10/2)復合物對雞胚絨毛尿囊膜(CAM)

8、的血管生成的促進作用的結(jié)果表明,裝載VEGF165-Ang-1雙基因的絲素蛋白多孔支架比裝載VEGF165或Ang-1單基因的多孔支架生成的血管更豐富,呈彌漫、放射狀血管形成。說明用ASF與PEI聯(lián)合包被VEGF165和Ang-1雙基因共表達載體質(zhì)粒,不僅細胞毒性較低,且VEGF165-Ang-1雙基因共表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后可以正常地表達、分泌相應的生長因子,從而促進血管形成。
　　本文不僅較系統(tǒng)地研究了ASF/PEI/DNA復合物