miRNA-451在膠質瘤細胞增殖—遷移表型轉換中的開關作用.pdf

1、膠質母細胞瘤(glioblastoma, GBM)是侵襲性最強的惡性膠質瘤，也是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，屬人類預后極差的腫瘤之一[1]。如果僅進行支持治療，膠質母細胞瘤病人的中位生存期不足3個月，97％的病人在12月內死亡;對于手術治療病人，由于腫瘤細胞在腦實質內呈彌漫浸潤性生長，常不能實現(xiàn)滿意的擴大切除。面對并不樂觀的現(xiàn)狀，現(xiàn)代醫(yī)學工作者依然不懈的致力于對膠質母細胞瘤治療手段的研究。近十余年來，微創(chuàng)理念和影像導引外科等新技術的

2、不斷發(fā)展，顯著提高了惡性腦腫瘤影像學全切除率，并降低了術后致殘、致死率，同時各種改良的綜合治療措施和新療法也為膠質母細胞瘤的治療帶來了新希望。目前，盡管腫瘤切除手術后替莫唑胺(temozolomide，TMZ)聯(lián)合常規(guī)分割照射的標準治療方案有了值得關注的發(fā)展[2]，接受標準方案治療的新診斷的膠質母細胞瘤患者相對于單純放療的患者二年生存率由10.9％提高到27.2％，三年生存率由4.4％提高到16％，但膠質母細胞瘤的侵襲遷移生物學特性依然

3、嚴重制約著各種治療手段的進一步提高。
　　腫瘤細胞的增殖和運動密切相關。早在1996年就有研究提出了腫瘤細胞的“go or grow”假說[3，4]。當腫瘤細胞所處的局部微生態(tài)環(huán)境不利于腫瘤細胞的增殖時，腫瘤細胞會遷移至適宜腫瘤細胞生存和增殖的環(huán)境。在這一過程中，腫瘤細胞在適合的微環(huán)境中進行增殖與遷移表型的轉換，啟動相應的生物學變化。盡管對腫瘤細胞遷移運動和增殖轉換的分子調控機制還很不清楚，但腫瘤細胞的運動與增殖表型轉換肯定不是受

4、外部因素單獨影響的，在細胞增殖和細胞運動兩種表型復雜的分子和信號通路調控之間，細胞內應該存在一個表觀遺傳學的調控開關。微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一種內源性的非編碼RNA，對基因表達進行抑制性調控，調節(jié)包括增殖，分化，凋亡等多種腫瘤細胞的發(fā)生、發(fā)展過程[5]。最近研究表明，miR-451在遷移運動的膠質瘤細胞中明顯下調，miR-451調節(jié)KB1-AMPK通路，可能使膠質瘤細胞在不同的萄萄糖環(huán)境中分別表現(xiàn)出增殖活性

5、和遷移運動活性[6]。
　　本研究主要討論miR-451對膠質瘤細胞增殖和運動的作用，對膠質瘤細胞增殖相關蛋白mTOR和遷移調控蛋白Rac1活性的影響，以及miR-451調控AMPK，mTOR， Rac1蛋白的激活狀態(tài)的潛在機制。
　　本課題研究分為以下兩個部分:
　　第一部分明確miR-451在人腦膠質瘤中的表達情況，觀察miRNA-451對膠質瘤細胞增殖和運動的影響。我們收集40例膠質母細胞瘤(WHOⅣ)標本以及6

6、例顳葉癲癇手術患者的對照腦組織。本課題組運用qRT-PCR檢測不同標本中miR-451的表達情況。通過將miR-451類似物和抑制物轉染U87、U251、SNB19三個人腦膠質瘤細胞系，探討miRNA-451對膠質瘤細胞增殖和運動能力的作用。qRT-PCR驗證轉染效果;MTT實驗檢測細胞增殖活性;體外劃痕實驗和transwell遷移實驗檢測細胞的遷移能力。結果顯示:膠質母細胞瘤組織中miR-451的相對表達量是對照腦組織的(33.58±

7、5.19)％;MTT實驗表明miR-451對膠質瘤細胞增殖能力呈正性調節(jié)作用;劃痕實驗和transwell遷移實驗發(fā)現(xiàn)miR-451對膠質瘤細胞運動能力呈負性調節(jié)作用。
　　第二部分miR-451對膠質瘤細胞增殖及運動能力作用的潛在機制。1.課題組將miR-451類似物和抑制物轉染進入U87、U251、SNB19三個人腦膠質瘤細胞系，運用qRT-PCR驗證轉染效果;western blot技術檢測不同處理組細胞中p-AMPK、AM

8、PK、p-Raptor、Raptor、Rac1的表達;GST-pulldown技術檢測GTP-Rac1表達。結果顯示:各組細胞中AMPK、Raptor、Rac1的表達與miR-451的表達無明確相關性;p-AMPK、GTP-Rac1的表達量與miR-451表達呈負相關，與p-Raptor的表達呈正相關。2.為了進一步驗證結論，我們通過RNA干擾技術沉默U87、U251、SNB19三個人腦膠質瘤細胞系中AMPKa1的表達，在此基礎上轉染m

9、iR-451類似物和抑制物，qRT-PCR和western blot驗證轉染效果;MTT實驗檢測細胞增殖活性;體外劃痕實驗和transwell遷移實驗檢測細胞的遷移能力;western blot技術檢測不同處理組中p-AMPK、AMPK、p-Raptor、Raptor、Rac1的表達;GST-pulldown技術檢測GTP-Rac1表達。結果顯示:敲低AMPKa1后，miR-451對細胞增殖，遷移能力及相關蛋白p-Raptor、GTP-