載脂蛋白O表達(dá)及其細(xì)胞內(nèi)功能研究.pdf

1、載脂蛋白O(apoO)是2006年新發(fā)現(xiàn)的一種主要存在于高密度脂蛋白(HDL)中的載脂蛋白。但是，針對(duì)HDL的蛋白質(zhì)組學(xué)分析并沒有在HDL中發(fā)現(xiàn)apoO的存在，提示apoO的含量極低。目前尚缺乏對(duì)apoO進(jìn)行定量的方法，因此，apoO在血漿中的濃度和與血脂的相關(guān)性、以及在冠心病等病理生理狀態(tài)下的改變均尚屬未知。
　　 既往對(duì)HDL及其載脂蛋白的功能研究主要集中在細(xì)胞外，認(rèn)為其有介導(dǎo)細(xì)胞膽固醇流出、抗炎、抗氧化、保護(hù)內(nèi)皮等功能，但

2、是，最近研究發(fā)現(xiàn)，載脂蛋白不僅可以作為分泌型蛋白在細(xì)胞外發(fā)揮功能，也可滯留于細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和抗炎功能。ApoO的細(xì)胞內(nèi)定位提示其也可能在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝作用。基于前期研究和文獻(xiàn)報(bào)道中并沒有發(fā)現(xiàn)apoO對(duì)HDL質(zhì)量和功能的影響，采用RNAi技術(shù)沉默細(xì)胞內(nèi)apoO表達(dá)，從而進(jìn)一步深入探討apoO細(xì)胞內(nèi)的功能對(duì)揭示apoO的生理作用具有重要意義。
　　 目的：
　　 建立一種apoO定量檢測(cè)的方法，并測(cè)定正

3、常人和急性冠脈綜合征(ACS)患者的apoO濃度，探討其與血脂的相關(guān)性;構(gòu)建apoO RNA干擾(RNAi)的慢病毒載體，通過轉(zhuǎn)染細(xì)胞，篩選有效的干擾序列，沉默細(xì)胞內(nèi)apoO表達(dá);將apoO有效沉默后，基因芯片檢測(cè)基因表達(dá)譜改變并分析差異表達(dá)基因。
　　 方法：
　　 一.建立Dot-blot定量分析法測(cè)定正常人和急性冠脈綜合征患者血漿載脂蛋白O濃度
　　 用重組apoO蛋白免疫小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合、篩選及克隆化，得

4、到分泌穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞株;腹腔注射于Balb/c小鼠，收取腹水，純化后得到抗apoO單克隆抗體;用辣根過氧化物酶標(biāo)記抗apoO單克隆抗體;用蛋白稀釋度曲線確定蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍;用血漿稀釋度曲線確定實(shí)驗(yàn)中人血漿的稀釋倍數(shù);確定了該方法的最低檢測(cè)限，測(cè)定批間、內(nèi)變異，以觀察方法的敏感性和穩(wěn)定性。通過測(cè)定111例健康人群和50例ACS患者血漿apoO的濃度，分析apoO在不同人群中的變化趨勢(shì)及與血脂及高敏C反應(yīng)蛋白(hsCRP)的相關(guān)性。<

5、br>　　 二.載脂蛋白O siRNA的篩選及慢病毒載體構(gòu)建
　　 針對(duì)人apoO基因序列，設(shè)計(jì)3個(gè)RNAi靶序列和1個(gè)陰性對(duì)照序列。合成含有正義和反義Oligo DNA的互補(bǔ)DNA序列。經(jīng)退火形成雙鏈DNA。將雙鏈DNA克隆至pFU-GW-iRNA以構(gòu)建慢病毒載體，PCR篩選陽性克隆，DNA測(cè)序鑒定。由病毒包裝系統(tǒng)進(jìn)行包裝，擴(kuò)增病毒測(cè)定滴度。病毒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后，應(yīng)用real-time PCR和western-blot鑒定

6、干擾序列。
　　 三.載脂蛋白O細(xì)胞內(nèi)功能研究
　　 采用氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)、環(huán)糊精和油酸干預(yù)肝癌細(xì)胞株HepG2，real-time PCR檢測(cè)apoO表達(dá)改變;流式細(xì)胞儀分析apoO膜表達(dá);采用siRNA慢病毒載體沉默apoO表達(dá)后，采用全人類基因芯片檢測(cè)技術(shù)篩查差異表達(dá)基因，并通過real-time PCR對(duì)部分差異表達(dá)基因進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 結(jié)果：
　　 一.建立Dot-blot定量

7、分析法測(cè)定正常人和急性冠脈綜合征患者血漿載脂蛋白O濃度
　　 1、得到了三株分泌穩(wěn)定、生長(zhǎng)良好的亞克隆雜交瘤細(xì)胞株。用該三株雜交瘤細(xì)胞接種小鼠得到的腹水單抗效價(jià)達(dá)到了1∶104～1∶105;
　　 2、經(jīng)亞型鑒定結(jié)果顯示三株mAb均為IgG2 aκ;
　　 3、采用純化的apoO單克隆抗體2F1D10行western-blot檢測(cè)，特異性良好;
　　 4、建立了apoO的dot-blot定量檢測(cè)方法，根據(jù)

8、重組蛋白制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，該方法的線性范圍為31.25-1000ng/ml。批內(nèi)變異7.9％;批間變異7.4％;
　　 5、血漿滴度曲線結(jié)果表明，人血漿在1∶5到1∶160范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，取線性范圍中間整數(shù)倍1∶20稀釋度，作為實(shí)驗(yàn)中人血漿apoO濃度檢測(cè)的最佳稀釋倍數(shù);
　　 6、采用該方法，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)健康人與ACS患者血漿apoO濃度分別為2.21±0.83μg/ml和4.94±1.59μg/ml，兩組比較有顯著性差異

9、(P＜0.001);
　　 7、采用多變量回歸分析發(fā)現(xiàn)，ACS組apoO與(1)g(hsCRP)呈顯著正相關(guān)(r=0.48，P＜0.001);未發(fā)現(xiàn)apoO與其他血脂指標(biāo)相關(guān);Logistic回歸分析顯示apoO為ACS的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子(OR=5.49，95％ CI2.85-10.56，P＜0.001)。
　　 二.載脂蛋白O siRNA的篩選及慢病毒載體構(gòu)建
　　 1、PCR鑒定與DNA測(cè)序證實(shí)合成的寡核苷酸鏈插

10、入序列完全正確;
　　 2、采用MOI=10轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率幾乎達(dá)到100％;
　　 3、與陰性對(duì)照組相比，3組siRNA中，第2對(duì)能顯著降低apoO mRNA和蛋白表達(dá)(P＜0.001)，第1對(duì)和第3對(duì)siRNA轉(zhuǎn)染后對(duì)apoO mRNA和蛋白的表達(dá)無明顯影響(P＞0.05)。
　　 三.載脂蛋白o(hù)細(xì)胞內(nèi)功能研究
　　 1、與對(duì)照組相比，ox-LDL干預(yù)能顯著抑制apoO mRNA表達(dá)

11、50％(P＜0.05)，環(huán)糊精刺激后，apoO mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.001)，而油酸干預(yù)后，apoO mRNA表達(dá)無顯著改變(P＞0.05);
　　 2、流式細(xì)胞儀分析顯示apoO在細(xì)胞膜表面表達(dá);
　　 3、ApoO siRNA慢病毒載體可有效抑制apoO mRNA和蛋白表達(dá);
　　 4、全基因組芯片差異分析結(jié)果顯示，apoO沉默與對(duì)照組有282條差異表達(dá)基因，其中192條上調(diào)，90條下調(diào)。在這一基因

12、中，與細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝的基因有20個(gè)，與炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)的基因有8個(gè)。
　　 結(jié)論：
　　 1、我們純化了apoO的單克隆抗體，并且利用該抗體，首次建立了人血漿apoO檢測(cè)的dot-blot定量分析法;同時(shí)采用該方法，發(fā)現(xiàn)apoO在ACS患者中升高，可能為ACS的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)‘
　　 2、成功構(gòu)建了人apoO基因RNAi慢病毒載體;并成功篩選有效的人apoO基因siRNA序列，為研究apoO在細(xì)胞內(nèi)的功能奠定了基礎(chǔ)。<