第二代惡性瘧原蟲(chóng)多表位人工抗原疫苗的構(gòu)建和篩選.pdf

1、瘧疾是世界上最嚴(yán)重的傳染病之一，2008年有2.43億人感染瘧原蟲(chóng)，約86.3萬(wàn)人因患瘧疾死亡，而惡性瘧原蟲(chóng)是造成嚴(yán)重危害的主要“元兇”。近年來(lái)，雖然在“瘧疾控制”方面取得了顯著的成績(jī)，但對(duì)于預(yù)防性和治療性瘧疾疫苗的需求仍十分迫切。目前，針對(duì)瘧原蟲(chóng)生活史復(fù)雜，抗原的表達(dá)具有階段特異性、高度變異性等特點(diǎn)，亞單位、多表位嵌合疫苗成為抗惡性瘧疫苗的研究熱點(diǎn)。
　　 前期研究中，本實(shí)驗(yàn)室發(fā)明了“表位改組”技術(shù)，利用其構(gòu)建了具有極高表位連

2、接多樣性的多表位基因文庫(kù)，并篩選出了高免疫原性和體外抑制瘧原蟲(chóng)生長(zhǎng)能力的第一代多表位嵌合抗原M.RCAg-1，證實(shí)了“表位改組”技術(shù)的可行性。但是，由于其N端帶有載體來(lái)源的43肽以及6×His蛋白標(biāo)簽，雖然能夠用腸激酶（EK）切除，但成本過(guò)高，限制了M.RCAg-1的研究?jī)r(jià)值。
　　 本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了一系列改進(jìn)，包括：選擇了12個(gè)以惡性瘧原蟲(chóng)紅內(nèi)期主要的疫苗候選抗原為主的15個(gè)B細(xì)胞和Th細(xì)胞表位；在表位連接處引

3、入特定的間隔序列：在多表位抗原的N、C端固定引入抗原側(cè)翼序列FN和FC；所有多表位抗原序列均為瘧原蟲(chóng)來(lái)源，不含任何載體肽和蛋白標(biāo)簽，符合國(guó)家《人用重組DNA制品質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則》的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范。構(gòu)建并篩選得到了第二代多表位嵌合抗原疫苗。與此同時(shí)，通過(guò)對(duì)多表位嵌合抗原序列（表位）組成、二級(jí)結(jié)構(gòu)、免疫原性和瘧原蟲(chóng)體外生長(zhǎng)抑制率（GIA）水平的對(duì)比分析，初步探討了幾個(gè)參數(shù)間的關(guān)系。此外，建立了以C端固定肽的特異性多克隆IgY抗體為配基的免疫親

4、和層析，為文庫(kù)中多表位嵌合抗原的高效純化探索了新的途徑。
　　 主要取得以下進(jìn)展：
　　 1.成功構(gòu)建并得到具有高免疫原性和表位連接多樣性的第二代多表位嵌合基因文庫(kù)，同時(shí)其小鼠免疫血清對(duì)培養(yǎng)惡性瘧原蟲(chóng)天然蛋白具有識(shí)別多樣性。
　　 2.從基因文庫(kù)中篩選得到高免疫原性嵌合抗原D10，免疫大白兔后，總IgG和特異性IgG的GIA水平分別為47％和67％，高于陽(yáng)性對(duì)照抗原MSPl抗體的44％。此外，對(duì)72份疫區(qū)患者血清

5、的篩查發(fā)現(xiàn)，對(duì)D10抗原的識(shí)別率達(dá)到67％，且與患者蟲(chóng)血率顯著負(fù)相關(guān)，提示D10可能與惡性瘧疾保護(hù)有關(guān)。表明全序列為瘧原蟲(chóng)來(lái)源的嵌合抗原D10，具有繼續(xù)優(yōu)化開(kāi)發(fā)的價(jià)值。
　　 3.我們發(fā)現(xiàn)多表位嵌合抗原二級(jí)結(jié)構(gòu)中的“Coil-Helix-Coil-Helix”結(jié)構(gòu)影響抗原的免疫原性；同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)含有“連續(xù)4個(gè)Th細(xì)胞表位”結(jié)構(gòu)的多表位嵌合抗原具有更高的GIA水平。
　　 4.證實(shí)了在多表位嵌入肽段抗體中，抑制性和促進(jìn)性抗

6、體的存在，并推斷其以級(jí)聯(lián)或協(xié)同的方式影響總抗體的GIA水平。
　　 5.通過(guò)制備C端融合序列的特異性多克隆IgY抗體，建立了免疫親和純化文庫(kù)多表位嵌合抗原的新途徑。
　　 6.證實(shí)了基于Hydroethidine染料的流式細(xì)胞術(shù)，可以作為惡性瘧原蟲(chóng)蟲(chóng)血率及其生長(zhǎng)周期的相對(duì)定量分析方法，并將其工作濃度優(yōu)化為10μg/ml。
　　 本研究利用部分改進(jìn)的“表位改組”技術(shù)，構(gòu)建并篩選得到了具有較大開(kāi)發(fā)價(jià)值的多表位嵌合抗原