山羊骨骼肌衛(wèi)星細胞的分離及成肌調節(jié)因子的克隆、表達與功能初探.pdf

1、成肌調節(jié)因子（Myogenic regulatory factors, MRFs）屬于bHLH型蛋白，是目前公認的骨骼肌發(fā)生的最主要調控因子，其生物學活性保證了機體骨骼肌細胞的正常發(fā)育，同時也與肉用動物的生產性能息息相關。這類調節(jié)因子由兩個亞族構成，一類是由MyoD1和Myf5構成，參與胚胎發(fā)育時期成肌細胞的激活、發(fā)生，屬于成肌決定因子(determination-classMRFs);另一類負責成肌細胞的分化、融合，屬于成肌分化因子（

2、differentiation-class MRFs），其中典型的為MyoG。目前，關于MRFs家族的生物學功能的研究主要集中在小鼠和人類，對羊MRFs的報道甚少。故本實驗通過克隆成肌決定因子亞族典型成員MyoD1和成肌分化因子亞族典型成員MyoG，構建體外真核表達載體采用異位表達的方式驗證其表達活性與成肌活力，并通過睪丸注射法制備轉基因肉羊，最終獲得MyoD1和MyoG過表達肉羊，對轉基因肉羊新品種的創(chuàng)制提供參考或育種素材。主要研究內

3、容如下:
　　1.骨骼肌衛(wèi)星細胞的分離及其成肌分化根據骨骼肌衛(wèi)星細胞的獨特生理位置，對骨骼肌衛(wèi)星細胞分離方法加以改進，經肌絲分離、細胞釋放和差速貼壁純化等步驟獲得了高純度的衛(wèi)星細胞。經間接免疫熒光鑒定顯示:92.5±3.4％的細胞為Pax-7+細胞，93.0±1.8％的細胞為MyoD+細胞，表明SMSC純度在90％以上;經生長速度測定顯示SSC具有較快的生長速度，呈典型的“S”型生長;通過比較成肌誘導體系Ⅰ、Ⅱ的成肌效果，發(fā)現無血

4、清培養(yǎng)基具備更佳的誘導效果，并對成肌誘導體系Ⅱ誘導24 h后gSMSC進行IFA鑒定，結果顯示其Desmin陽性率為92.3±1.1％，MyHC陽性率為93.0±1.2％，表明誘導至24 h時有92％的細胞進入成肌分化過程。
　　2.MyoD1與MyoG基因的克隆及生物信息學分析采用TriZol法提取成肌誘導分化24 h gSMSC總RNA，經反轉錄，通過設計MyoD1、MyoG特異性引物，利用PrimeSTARMax DNA p

5、olymerase系統PCR體外克隆山羊MyoD1和MyoG基因的完整CDS，經T-A克隆后遞交上海Invitrogen進行測序分析。根據測序結果與綿羊、牛、豬、人和鼠進行同源比較，結果表明MyoD1、MyoG基因克隆成功，MyoD1和MyoG基因在物種之間有較高同源性，其與綿羊的編碼氨基酸同源性均為100％。通過在線工具分析顯示MyoD1和MyoG蛋白均不含信號肽，是細胞核定位的疏水性蛋白;經NCBI-CCD分析顯示MyoD1、Myo

6、G均含有典型的bHLH結構，此外MyoD1蛋白還含有Myf5亞族（成肌決定因子亞族）典型結構。
　　3.過表達MyoD1基因山羊皮膚成纖維細胞系建立及其成肌誘導分化研究采用組織貼壁法分離山羊皮膚成纖維細胞（goat skin fibroblast，GSF），并構建pEGFP-MyoD1真核表達載體。采用LipofectaminTM LTX旨質體介導pEGFP-MyoD1質粒轉染GSF，通過400μg/mL的G418連續(xù)14 d的篩

7、選后，采用IFA檢測MyoD1和Myf5的表達;采用成肌誘導培養(yǎng)對MyoD1異位表達GSF細胞株進行成肌誘導分化，在分化處理2-3 d時采用IFA檢測MyoG、Desmin和MyHC等成肌分化早期標志，結果顯示細胞90％以上細胞進入成肌分化狀態(tài)。表明MyoD1基因的異位表達能夠誘導GSF等細胞向成肌方向分化。
　　4.MyoG真核表達載體的構建與基因免疫法制備anti-MyoG血清利用分子生物學方法構建MyoG真核表達載體pcDN

8、A3.0-MyoG和真核融合表達載體pEGFP-MyoG。pcDNA3.0-MyoG經PEI按1μg∶1.5μg包裹形成質粒-脂質體復合物后，按100μg/只的劑量肌肉注射小鼠股四頭肌，在第一次基礎免疫和三次加強免疫后采用眼球采血法收集抗血清?？寡褰汭FA鑒定其抗體效價，并與anti-eGFP比較共同檢測eGFP-MyoG融合蛋白以確定其抗體特異性，結果顯示抗血清能夠特異性識別MyoG蛋白，可用于后續(xù)試驗檢測。
　　5.睪丸注射

9、法制備轉MyoD1綿羊和轉MyoG基因山羊質粒(pEGFP-MyoD1或pEGFP-MyoG)經線性化后，與PEI以1∶2的比例形成質粒-脂質體復合物，按每側睪丸300μL（100μg）的劑量進行注射，在第二次加強注射10d后，進行配種。配種完成后解剖獲得小鼠睪丸用于體視熒光顯微鏡觀察，顯示質粒-脂質體復合物注射處理的小鼠附睪管中含有綠色熒光物質，過精子涂片顯示精子活動劇烈，且精子頭部含有大量綠色熒光物質。同睪丸注射法制備轉基因小鼠一樣

10、，采用隨機打點注射的方法按3 mg質粒/（側·只）的劑量對湖羊（或徐淮山羊）進行睪丸注射，其中，pEGFP-MyoD1-PEI復合物注射處理湖羊公羊睪丸，pEGFP-MyoG-PEI復合物注射處理徐淮山羊。在第一次注射7天后加強注射一次，加強注射40d后與母羊進行自然交配。睪丸注射法制備轉基因湖羊和山羊，第一代累計獲得4只轉MyoD1-eGFP基因湖羊，陽性率6.7％(4/59);獲得13只轉eGFP-MyoG基因山羊，陽性率21.67