虎源H-,5-N-,1-亞型流感病毒HA基因與NP基因核酸疫苗和重組腺病毒活載體疫苗的實驗研究.pdf

1、[目的]構(gòu)建能夠分別表達虎源H5N1亞型流感病毒血凝素(HA)基因和核蛋白(NP)基因的真核表達質(zhì)粒以及表達HA和NP蛋白重組犬2型腺病毒(CAV-2)活載體疫苗（CAV-2-HA和CAV-2-NP），用所構(gòu)建的真核表達質(zhì)粒和活載體疫苗免疫小鼠，檢測各質(zhì)粒和活載體疫苗的免疫水平及其攻毒保護率，通過本實驗為哺乳動物H5N1亞型流感病毒核酸疫苗和重組活載體疫苗的應用研究提供理論與技術(shù)基礎。
　　 [方法]利用設計合成的HA和NP引物

2、，從A/Tiger/Harbin/132/2007(H5N1)毒株的雞胚尿囊增殖液中對該毒株的HA和NP基因進行PCR擴增、克隆和測序分析；應用常規(guī)分子生物學方法，構(gòu)建能夠分別表達H5N1亞型流感病毒HA和NP基因的真核表達質(zhì)粒pVAX-HA和pVAX-NP以及同時表達貓IL-18基因和H5N1亞型流感病毒NP/HA基因的雙表達質(zhì)粒pIRES2-IL-18-HA和pIRES2-IL-18-NP，應用間接免疫熒光和間接ELISA方法檢測各

3、真核表達質(zhì)粒在乳倉鼠腎傳代細胞(BHK-21)中的表達情況。
　　 然后將含有NP/HA基因的表達盒(CMV+NP/HA+PolyA)克隆入pVAXE3的SspⅠ酶切缺失處，分別獲得含有NP/HA表達盒的穿梭載體pVAX△E3-NP/HA。用SalⅠ+Nru1分別對pVAX△E3-NP/HA和pPoly2-CAV2進行雙酶切，將含有NP/HA表達盒的片段定向克隆入pPoly2-CAV2，獲得在E3區(qū)缺失處插入NP/HA表達盒的重

4、組質(zhì)粒pCAV-2-NP/HA。釋放CAV-2-NP/HA重組基因組，脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染犬腎細胞(DK)，獲得了能使DK細胞產(chǎn)生典型腺病毒樣細胞病變的重組病毒(CAV-2-NP/HA)。從形態(tài)學、基因組水平、NP/HA基因的轉(zhuǎn)錄、NP/HA蛋白的表達以及重組病毒的生長特征等方面進行鑒定。
　　 用所構(gòu)建的4種真核表達質(zhì)粒和2種重組病毒分別進行小鼠免疫實驗和攻毒保護實驗。真核表達質(zhì)粒的免疫實驗共設pVAX-HA、pVAX-NP、pVA

5、X-HA和pVAX-NP聯(lián)合、pIRES2-IL-18-HA、pIRES2-IL-18-NP、pIRES2-IL-18-HA和pIRES2-IL-18-NP聯(lián)合、PBS對照7個免疫組，每組11只小鼠，采用肌肉注射的方法，以15天的時間間隔免疫3次后15天，用間接ELISA方法檢測各免疫組小鼠產(chǎn)生的抗AIV的抗體水平；用MTT法檢測各免疫組小鼠產(chǎn)生的細胞免疫水平；用H5N1亞型流感病毒強毒株滴鼻攻毒，檢測各免疫組的攻毒保護率。
　　

6、 重組病毒的免疫實驗共設CAV-2-HA、CAV-2-HA和CAV-2-NP聯(lián)合免疫、CAV-2三組，每組13只小鼠。采用滴鼻(50μL)+皮下注射(250μL)的免疫方法，以14天的時間間隔共免疫接種2次。每次免疫后14天，每組各撲殺2只采血收集血清，剩下9只中3只用于攻毒后4天處死，測定攻毒后肺滴度，剩余6只用于檢測攻毒后的保護率。[結(jié)果]成功克隆了A/Tiger/Harbin/132/2007(H5N1)毒株的HA和NP全基因，

7、長度分別為1704bp和1479bp，分別編碼568和493個氨基酸。成功構(gòu)建了表達虎源H5N1亞型流感病毒HA和NP蛋白的4種真核表達質(zhì)粒(pVAX-HA、pVAX-NP、pIRES2-IL-18-HA和pIRES2-IL-18-NP)和2種重組病毒(CAV-2-HA和CAV-2-NP)。
　　 這4種真核表達質(zhì)粒均能在BHK-21細胞中表達具有生物活性的HA和NP蛋白，均能誘導小鼠產(chǎn)生特異性的細胞免疫和體液免疫，各免疫組小鼠

8、在受到超大劑量（10000MLD50/只）的強毒攻擊后，各組免疫保護率分別為：pVAX-HA組60％、pVAX-NP組20％、pVAX-HA和pVAX-NP聯(lián)合組60％、pIRES2-IL-18-HA組20％、pIRES2-IL-18-NP組0％、pIRES2-IL-18-HA和pIRES2-IL-18-NP聯(lián)合組20％、PBS對照組0％。
　　 CAV-2-NP/HA具有典型的CAV-2形態(tài)特征，CAV-2-NP/HA在繁殖的

9、過程中沒有對H5N1NP/HA表達盒片段進行缺失或重排，并且能夠轉(zhuǎn)錄H5N1NP/HA的mRNA，ELISA和免疫熒光分析表明重組表達產(chǎn)物可被流感病毒NP/HA單克隆抗體所識別，在體外具有良好的遺傳穩(wěn)定性。動物免疫實驗表明CAV-2-HA、CAV-2-NP兩種重組活載體疫苗均能誘導小鼠產(chǎn)生特異性的免疫反應，以CAV-2-HA效果最好，對小鼠的攻毒保護率為83.3％，CAV-2-HA和CAV-2-NP聯(lián)合免疫的保護率為16.7％，對照組(