過表達人LDH-C的CHO細胞株構建及其對乳酸代謝和細胞凋亡影響的研究.pdf

1、重組蛋白藥物因為其具有高活性、特異性強、低毒性、生物功能明確、有利于臨床應用的特點,已成為醫(yī)藥產(chǎn)品中的重要組成部分,現(xiàn)已廣泛的應用于治療各種疾病包括自身免疫性疾病、腫瘤等。但是生產(chǎn)能力不足已經(jīng)成為重組藥物發(fā)展的瓶頸,為滿足不斷擴大的市場需要,重組蛋白質(zhì)產(chǎn)量的增加不僅僅通過擴大反應器的體積來實現(xiàn),更重要的是通過細胞工程技術改造獲得一個細胞生長周期長,產(chǎn)量高,代謝廢物少、抗凋亡的細胞株。在CHO細胞生長過程中,特別是在分批培養(yǎng)過程的后期,乳

2、酸積累是限制細胞密度的重要原因之一,乳酸還會導致培養(yǎng)基pH下降,而在生物反應器中為調(diào)整pH值添加堿性物質(zhì)還會導致滲透壓升高,進而對細胞的生長產(chǎn)生不利的影響,最終導致細胞活率以及蛋白產(chǎn)量的降低。LDH-C基因存在于精子細胞、睪丸細胞和某些腫瘤中,作為乳酸脫氫酶(LDH)的一個亞型,同乳酸脫氫酶A和B相比,LDH-C更偏向于利用乳酸作為底物,催化乳酸向丙酮酸方向發(fā)生反應。LDH-C有助于精子在高乳酸的環(huán)境中生存,同時它允許乳酸作為細胞能量的

3、來源。雖然LDH-C在CHO細胞中的作用目前還不清楚,但是LDH-C可以作為細胞工程上的一個有趣的靶點,它可能會使CHO細胞代謝向有氧乳酸代謝方向轉(zhuǎn)變,改善細胞生長的高乳酸環(huán)境。因此我們猜想在CHO細胞中過表達LDH-C基因可能會對改善細胞培養(yǎng)的高乳酸環(huán)境從而抑制細胞凋亡。本研究旨在通過在CHO細胞中過表達人LDH-C基因,改善細胞培養(yǎng)后期的高乳酸環(huán)境,從而減少高乳酸引起的細胞凋亡。本研究的意義在于為減少代謝副產(chǎn)物乳酸提供新的途徑,為提

4、高抗體或重組蛋白類藥物的產(chǎn)量奠定基礎。
　　目的：在工程細胞CHO中過表達乳酸脫氫酶(LDH-C)基因,旨在利用基因工程手段構建出培養(yǎng)時間長、代謝副產(chǎn)物少、抗凋亡的細胞株,為抗體產(chǎn)量的增加奠定基礎。
　　方法：運用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)從人SKBR-3細胞中擴增出LDH-C基因,經(jīng)雙酶切(XhoⅠ和HindⅢ)后與真核表達載體pcDNA3.0相連接,利用Lipo2000轉(zhuǎn)染至CHO細胞,經(jīng)G418加壓篩選獲得穩(wěn)

5、定表達LDH-C的單克隆細胞株。經(jīng)Real-time PCR檢測LDH-C基因在mRNA水平的表達量,挑選出三株表達量比較高的細胞株進行補料分批培養(yǎng),通過對比實驗組細胞 CHO/LDH-C和對照組細胞CHO/pcDNA3.0的生長曲線、細胞活率以及IVCC曲線等參數(shù),獲得一株IVCC值最高的細胞。在三種不同的分批補料培養(yǎng)條件下,觀察LDH-C對細胞生長的影響,每天記錄細胞生長的密度,并用臺盼藍拒染法計算細胞的活率,同時每天檢測細胞培養(yǎng)上

6、清中代謝產(chǎn)物乳酸的含量,以研究LDH-C對CHO代謝的影響。對CHO/LDH-C進行細胞周期檢測、Annexin V與PI雙染檢測細胞凋亡率、JC-1染色檢測兩組細胞的線粒體膜電位以及western-blot檢測細胞凋亡通路中的相關蛋白表達,以研究LDH-C對凋亡的影響。
　　結果：⑴成功克隆人LDH-C基因,構建真核表達載體pcDNA3.0/LDH-C,并成功獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO/LDH-C細胞株。通過Real-timePCR鑒

7、定、流加培養(yǎng)生長曲線以及酶活鑒定等實驗獲得一株LDH-C表達量較高,生長密度較高的6號克隆CHO/LDH-C＃6作為后續(xù)實驗的研究對象。同時,選取CHO/pcDNA3.0＃4作為實驗的對照組。⑵在初始培養(yǎng)條件下,兩組細胞的生長無明顯差別,但是在第三天分別加入40mM丙酮酸鈉或者40mM乳酸鈉后,對照組細胞的生長受到了抑制,而轉(zhuǎn)染了LDH-C的實驗組細胞生長密度顯著高于對照組細胞,并且在這兩種培養(yǎng)條件下實驗組細胞的乳酸濃度明顯低于對照組,

8、特別是在流加培養(yǎng)的后期,LDH-C的作用更加顯著,可以顯著性降低乳酸濃度。⑶利用流式細胞儀檢測細胞周期,結果顯示轉(zhuǎn)染后的CHO/LDH-C細胞S期增加,說明處于DNA復制期的細胞增多,增殖活性增加。流式檢測細胞凋亡、western-blot以及線粒體膜電位檢測均顯示CHO/LDH-C細胞細胞凋亡降低,說明過表達LDH-C通過可以抑制CHO細胞的凋亡。
　　結論：本課題成功構建穩(wěn)定表達人LDH-C基因的CHO/LDH-C細胞,并在補