簡(jiǎn)介：天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文重組腺病毒ADPEDF的構(gòu)建及其真核表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究姓名于燕萍申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專(zhuān)業(yè)眼科學(xué)指導(dǎo)教師顏華20070501天津醫(yī)科大學(xué)碩士研究生畢業(yè)論文夠轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞使其表達(dá)PEDF，并分泌到細(xì)胞外。結(jié)論成功構(gòu)建出攜帶PEDF基因的重組腺病毒ADPEDF，為基因治療CNV奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞色素上皮衍生因子；重組；基因治療；脈絡(luò)膜新生血管；腺病毒

簡(jiǎn)介：目前，登革病毒DV廣泛流行于全世界100多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，據(jù)WHO估計(jì)，全球每年約有5千萬(wàn)至1億人感染登革病毒。我國(guó)南方近年來(lái)也頻發(fā)小流行，僅2002年廣州和澳門(mén)地區(qū)就有近萬(wàn)人感染。登革熱已經(jīng)成為一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的蚊媒傳播疾病，被認(rèn)為是急需引起重視的一種再現(xiàn)突發(fā)性傳染性疾病。登革病毒分為4個(gè)血清型，DV1～DV4，任何型別的登革病毒感染均可引起一系列的臨床癥狀，包括隱性感染、發(fā)熱、登革熱DF及更為嚴(yán)重的登革出血熱DHF和登革休克綜合征DSS。登革病毒的初次感染對(duì)于同型病毒的再次感染可產(chǎn)生長(zhǎng)久的免疫力，但對(duì)于其它型別登革病毒的再次感染則僅有部分而短暫的免疫保護(hù)作用。血清流行病學(xué)的調(diào)查研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，異型病毒的再次感染是引發(fā)DHFDSS的高危因素。目前具有保護(hù)性的登革病毒疫苗尚未研制成功，臨床上對(duì)于登革病毒的感染亦未有特異性的治療措施，但研究表明及早的臨床處理可以減少DHF的發(fā)病率和致死率。由于多數(shù)登革病毒感染者早期缺乏特異的臨床表現(xiàn)，僅有發(fā)熱、寒戰(zhàn)等流感樣癥狀，難以和其它發(fā)熱疾病和出血熱疾病區(qū)分，必須依賴(lài)實(shí)驗(yàn)室的診斷加以確認(rèn)。因此，為了使感染患者及時(shí)得到救治，減少DHF的發(fā)病率，建立一種快速、特異的實(shí)驗(yàn)室早期診斷方法顯得尤為重要。而且，進(jìn)一步明確感染病毒的血清型對(duì)于流行病學(xué)和發(fā)病機(jī)理的研究也是非常必要的，有研究已證實(shí)登革病毒感染的血清型與發(fā)病嚴(yán)重程度存在著密切的相關(guān)性，譬如Ⅱ型登革病毒的感染往往引發(fā)較其它3型嚴(yán)重的臨床癥狀。目前，登革病毒的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要包括病毒分離、血清學(xué)檢測(cè)和核酸檢測(cè)。病毒分離是登革病毒感染診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，并可進(jìn)一步用于病毒血清型的鑒定，但是該方法費(fèi)時(shí)而且對(duì)于實(shí)驗(yàn)室的條件要求較高。盡管病毒核酸的檢測(cè)方法比傳統(tǒng)的病毒分離法更靈敏快速，但是分子生物學(xué)方法需要特殊的實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備和操作技術(shù)，并較易發(fā)生污染導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。而血清學(xué)檢測(cè)方法不能用于早期診斷，而且由于存在四種血清型登革病毒和其它黃病毒抗原之間的交叉反應(yīng)，結(jié)果易發(fā)生假陽(yáng)性。此外，對(duì)登革病毒的分型診斷也存在問(wèn)題，目前主要依靠從急性期血樣品中分離病毒，結(jié)合血清型特異性的單克隆抗體進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)或利用型特異引物進(jìn)行RTPCR鑒定，這兩者在操作上均無(wú)法達(dá)到快速簡(jiǎn)便和大量篩查的要求。因此，亟需建立一種更為簡(jiǎn)便特異的登革病毒感染早期診斷及分型診斷方法。登革病毒屬于黃病毒科黃病毒屬的主要成員，是一種具有包膜的單股正鏈RNA病毒，基因組長(zhǎng)約11KB，編碼3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白C、PRMM、E和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白NS1NS2ANS2BNS3NS4ANS4BNS5，其中NS1是研究比較深入的非結(jié)構(gòu)蛋白，該蛋白以膜型和分泌型兩種形式存在，具有群特異性和型特異性決定簇，但對(duì)NS1的功能尚未完全清楚，有研究發(fā)現(xiàn)在登革熱患者的早期血中存在高濃度的NS1循環(huán)抗原，而檢測(cè)NS1IGG可初步進(jìn)行登革病毒的分型，因此，我們推測(cè)NS1可望成為登革病毒感染的早期診斷及病毒分型診斷靶標(biāo)。本研究結(jié)合我國(guó)廣東地區(qū)近年主要以Ⅰ型登革病毒流行的特點(diǎn)，選擇了Ⅰ型登革病毒NS1蛋白DV1NS1為研究的靶抗原，通過(guò)對(duì)NS1基因的克隆、蛋白表達(dá)及其抗原性鑒定，并通過(guò)制備一組特異性抗Ⅰ型登革病毒NS1蛋白的單克隆抗體，建立以單克隆抗體為基礎(chǔ)的雙抗體夾心捕獲DV1NS1抗原的酶聯(lián)免疫學(xué)方法，探討NS1在登革病毒感染早期診斷及分型診斷中的作用和意義。本研究主要分為四個(gè)部分第一部分Ⅰ型登革病毒NS1基因克隆及抗原性鑒定用RTPCR方法擴(kuò)增Ⅰ型登革病毒NS1全長(zhǎng)基因，并定向克隆至原核表達(dá)載體PQE30中，PQE30為攜帶6個(gè)組氨酸HIS6標(biāo)簽的融合蛋白表達(dá)載體，通過(guò)對(duì)表達(dá)條件和純化條件的優(yōu)化，經(jīng)NINTA親和層析成功純化獲得融合蛋白，命名為DV1NS1。表達(dá)蛋白經(jīng)WESTERNBLOT和ELISA鑒定，證明了可與登革熱患者血清和兔免疫血清特異結(jié)合，具有良好的抗原性，為進(jìn)一步研究免疫診斷試劑奠定了基礎(chǔ)。第二部分Ⅰ型登革病毒NS1蛋白特異性單克隆抗體的制備及鑒定本部分研究在成功獲得具有抗原性的DV1NS1蛋白的基礎(chǔ)上，制備抗Ⅰ型登革病毒NS1蛋白特異性單抗，并對(duì)單抗進(jìn)行免疫學(xué)特性研究、抗體識(shí)別抗原位點(diǎn)分析以及血清型特異性鑒定。采用三種免疫方案免疫BALBC小鼠，分別為DV1病毒全程免疫、DV1NS1蛋白全程免疫和兩者的混合交替免疫，取抗體效價(jià)高的小鼠脾臟與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，對(duì)陽(yáng)性的克隆細(xì)胞株進(jìn)行有限稀釋法亞克隆化，經(jīng)分別以NS1蛋白和DV1病毒為抗原的兩種間接ELISA篩選，結(jié)合免疫熒光鑒定，最終獲得了10株穩(wěn)定分泌抗NS1蛋白特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。10株單抗IG亞類(lèi)測(cè)定，9株為IGG1，1株為IGG2A?？贵w親和常數(shù)介于106～10100M。WESTERNBLOT和IFA鑒定除1株單抗與所有4型登革病毒交叉反應(yīng)外，其余的9株特異結(jié)合Ⅰ型登革病毒NS1，與其余3型登革病毒不發(fā)生交叉反應(yīng)，為血清型特異性單抗。采用相互競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)分析單抗識(shí)別抗原表位，結(jié)果顯示10株單克隆抗體識(shí)別6個(gè)以上不完全相同的抗原位點(diǎn)，并均能和天然病毒抗原結(jié)合，為下一步建立雙抗體夾心抗原檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)。第三部分Ⅰ型登革病毒NS1抗原檢測(cè)方法的建立根據(jù)單抗識(shí)別抗原位點(diǎn)、抗體親和力以及抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果，進(jìn)行組合配對(duì)以篩選出最佳的抗體組合。用酶標(biāo)記每一株單抗，將每一株單抗作為捕獲抗體分別與其它株酶標(biāo)記單抗作為檢測(cè)抗體進(jìn)行相互配對(duì)試驗(yàn)，通過(guò)檢測(cè)登革病毒培養(yǎng)上清及檢測(cè)NS1蛋白的靈敏性和特異性，結(jié)合檢測(cè)正常人血的本底值高低，經(jīng)反復(fù)多次篩選，最終確定了以單克隆抗體1F31A5和HRP5I41A3組合用于構(gòu)建檢測(cè)方法。建立的雙抗體夾心抗原捕獲法檢測(cè)重組NS1蛋白的靈敏度為5NGML，其線(xiàn)性檢測(cè)范圍為100～2000NGML。進(jìn)一步檢測(cè)不同血清型的登革病毒毒株和其它黃病毒的病毒培養(yǎng)液，結(jié)果顯示，采用血清型特異性單抗建立的雙抗體夾心抗原捕獲法僅特異的檢測(cè)到Ⅰ型登革病毒，而與其它病毒無(wú)交叉反應(yīng)，檢測(cè)方法具有型特異性。本部分研究表明，采用抗體夾心抗原捕獲法建立的NS1蛋白檢測(cè)方法具有高敏感性和特異性，可為登革病毒感染提供一種新的實(shí)驗(yàn)室診斷方法。第四部分Ⅰ型登革病毒NS1抗原捕獲ELISA初步臨床研究通過(guò)對(duì)大量臨床血清樣品的檢測(cè)，探討所建立方法在登革病毒感染早期診斷中的價(jià)值，并進(jìn)一步評(píng)價(jià)其在血清型分型診斷中的作用。采用建立的方法檢測(cè)了469例正常人血清樣品，確立檢測(cè)的臨界值。在469例正常血清樣品中，僅有5例為弱陽(yáng)性，檢測(cè)特異性達(dá)99％。對(duì)462例2002～2003年廣東地區(qū)Ⅰ型登革病毒流行期間采集的血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明在發(fā)病的早期可以檢測(cè)到高水平的NS1循環(huán)抗原，而且直至發(fā)病第18天，仍可以檢測(cè)到血清中存在NS1抗原。在發(fā)病后第1～2天、3～5天、6～10天、11～15天和16～20天各階段采集的血清樣品中，NS1蛋白的陽(yáng)性率分別為528％、681％、838％、50％和20％。對(duì)該462例患者血清，同時(shí)也進(jìn)行了登革病毒特異性IGM抗體的檢測(cè)，發(fā)病后1～2天，IGM的陽(yáng)性檢出率僅為174％，6～10天IGM陽(yáng)性率上升至75％，隨后可升高至80％并維持至發(fā)病后16～20天。通過(guò)分析血清中NS1抗原存在和DVIGM抗體產(chǎn)生的規(guī)律，發(fā)現(xiàn)在病程的急性期，兩者的檢測(cè)規(guī)律一致，但是在此期間NS1抗原保持著較高的陽(yáng)性檢出率。尤其在發(fā)病的第1～3天，即可檢測(cè)到較高水平的NS1抗原存在，表明NS1抗原的檢測(cè)適合于登革病毒感染的早期診斷。對(duì)17例經(jīng)型特異RTPCR鑒定為DV1感染的確診血清進(jìn)行檢測(cè)，有14例DV1NS1抗原陽(yáng)性，因此建立的抗原捕獲ELISA檢測(cè)靈敏度為82％。進(jìn)一步應(yīng)用雙抗體夾心抗原捕獲ELISA檢測(cè)了20例Ⅱ型登革熱陽(yáng)性血清及1例Ⅲ型登革熱陽(yáng)性血清，結(jié)果呈陰性；檢測(cè)13例日本腦炎病毒感染陽(yáng)性血清、56例麻疹病毒感染陽(yáng)性血清、51例漢坦病毒感染陽(yáng)性血清和20例鉤端螺旋體感染陽(yáng)性血清，結(jié)果亦呈陰性，表明建立的方法具有登革病毒血清型特異性而且同其它相關(guān)或無(wú)關(guān)病毒無(wú)交叉反應(yīng)，具有高度的特異性，為分型診斷和鑒別診斷奠定了基礎(chǔ)。綜合以上四個(gè)部分的研究結(jié)果，本研究的結(jié)論如下一、成功獲得具有良好抗原性的Ⅰ型登革病毒NS1重組蛋白，并進(jìn)一步制備了多株具有血清型特異性的Ⅰ型登革病毒NS1單克隆抗體，為免疫診斷試劑研制、NS1蛋白功能的研究、登革病毒感染的發(fā)病機(jī)理及疫苗研制等奠定基礎(chǔ)。二、率先建立了雙單克隆抗體夾心的NS1抗原捕獲ELISA，能靈敏的檢測(cè)到急性期血中的NS1抗原，適用于登革病毒感染的早期診斷；并可進(jìn)一步發(fā)展為病毒抗原定量分析試劑，用于登革病毒感染患者臨床預(yù)后的判斷。三、率先建立了具有Ⅰ型登革病毒特異性的NS1抗原捕獲ELISA，可特異的檢測(cè)Ⅰ型登革病毒NS1抗原，與其它相關(guān)病毒均無(wú)交叉反應(yīng)，具有型特異性，有望應(yīng)用于登革病毒感染的快速分型診斷或鑒別診斷。

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簡(jiǎn)介：人們每天面對(duì)紛繁復(fù)雜的信息，既有有效的信息，又有無(wú)關(guān)的信息。為了能夠更加有效地工作、生活，人們必須將注意力集中在有效信息上，同時(shí)抑制無(wú)關(guān)信息的影響。特別地，當(dāng)兩類(lèi)信息互相沖突時(shí)，人們必須付出更過(guò)的認(rèn)知努力才能達(dá)到同樣的效率。因此，采用科學(xué)心理學(xué)的研究方法探究沖突的產(chǎn)生、發(fā)展及其神經(jīng)生理機(jī)制對(duì)于人們的幸福生活有深遠(yuǎn)意義。根據(jù)信息的類(lèi)別，目前科研領(lǐng)域?qū)_突劃分為情緒沖突和認(rèn)知沖突兩種類(lèi)型。當(dāng)能喚醒情緒的信息相互間產(chǎn)生加工沖突時(shí)，稱(chēng)之為情緒沖突當(dāng)中性刺激相互間產(chǎn)生認(rèn)知加工沖突，稱(chēng)之為認(rèn)知沖突。關(guān)于認(rèn)知沖突的研究一直是心理學(xué)的研究熱點(diǎn)。情緒沖突的研究范式主要是由成熟的認(rèn)知沖突研究范式發(fā)展而來(lái)。比如與經(jīng)典STROOP范式相近的情緒STROOP范式以及相對(duì)應(yīng)的詞面孔范式，與經(jīng)典FLANKER范式相對(duì)應(yīng)的情緒FLANKER范式。詞面孔范式更有助于對(duì)情緒沖突心理加工機(jī)制的理解。這也表現(xiàn)在近些年詞面孔范式的廣泛使用和認(rèn)可上。前人利用功能磁共振技術(shù)研究了情緒沖突的腦機(jī)制，普遍認(rèn)為前額葉和邊緣系統(tǒng)與情緒沖突有關(guān)。特別地，有背部前扣帶與情緒沖突監(jiān)控有關(guān)，研究者發(fā)現(xiàn)喙部前扣帶回與情緒沖突解決有關(guān)，同時(shí)喙部扣帶回與杏仁核間的功能連接是情緒沖突解決的關(guān)鍵環(huán)路。但是有也有有研究發(fā)現(xiàn)這一機(jī)制僅存在于在高焦慮被試身上。因此，目前關(guān)于情緒沖突神經(jīng)機(jī)制的研究還存在爭(zhēng)議，爭(zhēng)議一方面源于所采用的實(shí)驗(yàn)方法上。爭(zhēng)議另一方面來(lái)源于這些研究本身所共有的缺陷。其一，它們樣本量普遍都比較小，有研究證明，小樣本統(tǒng)計(jì)力度較小，不容發(fā)現(xiàn)潛在相關(guān)的腦區(qū)其二，它們只考慮了功能，而沒(méi)有考慮大腦結(jié)構(gòu)，以往研究證明功能不等于結(jié)構(gòu)，形態(tài)學(xué)的研究可能目前的爭(zhēng)論帶來(lái)新的觀點(diǎn)。盡管目前已經(jīng)有關(guān)于精神障礙情緒沖突機(jī)制的研究，但是關(guān)于老年人情緒沖突機(jī)制的研究卻很少。研究老年人的情緒沖突機(jī)制一方面有利于加深、修訂已有的情緒沖突理論模型，另一方面，也有利于改善、指導(dǎo)老年人的晚年幸福生活。本研究將采用磁共振技術(shù)探究情緒沖突的認(rèn)知神經(jīng)機(jī)制。實(shí)驗(yàn)一采用磁共振技術(shù)，單因素雙水平（沖突條件和非沖突條件）的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用基于體素的形態(tài)學(xué)核磁數(shù)據(jù)分析方法，探究情緒沖突效應(yīng)個(gè)體差異的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。發(fā)現(xiàn)腦區(qū)的灰質(zhì)密度與情緒沖突效應(yīng)顯著相關(guān)，基本支持了前人的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)二采用功能磁共振技術(shù)，雙因素雙水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，探究情緒沖突的大腦老齡化效應(yīng)。發(fā)現(xiàn)老年被試在“一致減不一致”對(duì)照下默認(rèn)網(wǎng)絡(luò)激活更強(qiáng)，說(shuō)明了老年被試默認(rèn)網(wǎng)絡(luò)的老齡化異常。

簡(jiǎn)介：四川師范大學(xué)學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交學(xué)位論文逯蚤迥耋揸配童昱理塞趁叢翅僉盤(pán)壁盟處這蚤塾堂筮墮墊拯二二絲名邐麴坷塹空遞量遞蘊(yùn)趔，是本人在導(dǎo)師型篷蘧指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中己經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的作品或成果。對(duì)本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均己在文中以明確方式標(biāo)明。本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。本人承諾己提交的學(xué)位論文電子版與論文紙本的內(nèi)容一致。如因不符而引起的學(xué)術(shù)聲譽(yù)上的損失由本人自負(fù)。學(xué)位論文作者噌舞軋簽字日期細(xì)一F年S月衛(wèi)F日四川師范大學(xué)學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū)本人同意所撰寫(xiě)學(xué)位論文的使用授權(quán)遵照學(xué)校的管理規(guī)定學(xué)校作為申請(qǐng)學(xué)位的條件之一，學(xué)位論文著作權(quán)擁有者須授權(quán)所在大學(xué)擁有學(xué)位論文的部分使用權(quán)，即1已獲學(xué)位的研究生必須按學(xué)校規(guī)定提交印刷版和電子版學(xué)位論文，可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)供檢索；2為教學(xué)、科研和學(xué)術(shù)交流目的，學(xué)校可以將公開(kāi)的學(xué)位論文或解密后的學(xué)位論文作為資料在圖書(shū)館、資料室等場(chǎng)所或在有關(guān)網(wǎng)絡(luò)上供閱讀、瀏覽。本人授權(quán)萬(wàn)方數(shù)據(jù)電子出版社將本學(xué)位論文收錄到中國(guó)學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù)，并通過(guò)網(wǎng)絡(luò)向社會(huì)公眾提供信息服務(wù)。同意按相關(guān)規(guī)定享受相關(guān)權(quán)益。保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書(shū)學(xué)位論文作者簽名田缸簽字ET期矽IS年S月21日導(dǎo)師簽名劃婚羲簽字日期矽』蚌6月了LFT萬(wàn)方數(shù)據(jù)ABSTRACTTHEANALYSISOFLEXICALCOLLOCATIONVARIATIONINMODERNCHINESEANDTCSL“L‘1一SETNONNS，VERBS。AD|ECTIVESANNQUANTITIERSASEXAMDLESTEACHINGCHINESEASASECONDLANGUAGEBYLEIYMGSUPERVISORLIUHAIYANABSTRACTTHEREARELEXICALCOLLOCATIONVARIATIONSINMODEMCHINESE，SUCHAS‘‘ANEYEBROWCRESCENT”MEANSTHECHIVEOFTHEMOONISJUSTLIKEANEYEBROW，‘‘VERYWOMALL’MEANSVERYCHARMINGETCIT’SQUITECOMMONFORCHINESENATIVESPEAKERSTOENCOUNTERTHESEVARIATIONSFURTHERMORE，THEREARENOMISTAKESINTHEIRCOMPREHENSIONANDUSAGEHOWEVERASFORLEARNERSWHOSTUDYCHINESEASASECONDLANGUAGE，THEYWOULDFEELCONFUSEDANDOBSESSEDTHISPAPERANALYZESTHECOLLOCATIONVARIATIONSCHAPTERONEISINTRODUCTION，WHICHANALYZESBASICTHEORIESANDCHARACTERISTICSOFCOLLOCATIONVARIATIONS，ANDELABORATESSIGNIFICANCEANDPRINCIPLESOFTHISTHESISINCHAPTERTWO，ITEXPLICITLYELABORATESTHECHARACTERISTICSOFTHEVARIATIONSTHROUGHTHEANALYSISOFFLEXIBLEUSAGEOFNOUNS，VERBS，ANDADJECTIVESINCHAPTERTHREE，ITANALYZESTHECAUSESOFTHEVARIATIONSFROMTHECOGNITIVEPERSPECTIVEINCHAPTERFOURACCORDINGTOTHEANALYSISOFONTOLOGYANDTHEORIESOFTCSL，ITELABORATESTHESIGNIFICANCEOFTHECOLLOCATIONVARIATIONSANDCOMESUPWITHTEACHINGMETHODSOFTHECOLLOCATIONVARIATIONSKEYWORDSLEXICALCOLLOCATIONVARIATIONSTCSLCOGNITIVETEACHINGMETHODSIII萬(wàn)方數(shù)據(jù)

簡(jiǎn)介：研究背景和目的糖尿病腎病DN是糖尿病常見(jiàn)并發(fā)癥之一，也是糖尿病患者致死、致殘的主要原因。高血糖環(huán)境中，細(xì)胞外基質(zhì)ECM成分的堆積是糖尿病腎病發(fā)生和進(jìn)展的最主要原因。越來(lái)越多的證據(jù)表明系膜細(xì)胞自分泌的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子Β1TGFΒ1是高血糖對(duì)腎臟作用的重要中介。高糖環(huán)境中下調(diào)TGFΒ1信號(hào)的治療途徑為我們提供了一個(gè)抑制DN發(fā)生、發(fā)展的途徑。蛋白聚糖Ⅱ，又稱(chēng)DECINDCN是一個(gè)37KD，分泌性蛋白聚糖。DCN可調(diào)節(jié)基本生物學(xué)功能，如基質(zhì)組裝，纖粘蛋白和血小板反應(yīng)素介導(dǎo)的細(xì)胞粘附的調(diào)節(jié)。更重要的是DCN是TGFΒ1的天然拮抗劑。有證據(jù)說(shuō)明DCN通過(guò)其核心蛋白與TGFΒ1結(jié)合可以直接中和其活性。為更好地揭示在高血糖環(huán)境下，上調(diào)DCN對(duì)TGFΒ1活性、細(xì)胞增殖、細(xì)胞外1基質(zhì)堆積以及組織纖維化的抑制作用，并探討DCN基因轉(zhuǎn)染防治DN的可能性，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察腺病毒介導(dǎo)大鼠蛋白聚糖Ⅱ基因ADDCN轉(zhuǎn)染對(duì)高糖培養(yǎng)的大鼠腎系膜細(xì)胞的影響，從細(xì)胞水平闡明DCN基因轉(zhuǎn)染治療糖尿病腎病的可能性。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和方法1在AD293細(xì)胞中，體外擴(kuò)增大鼠蛋白聚糖Ⅱ基因重組腺病毒ADDCN，由本實(shí)驗(yàn)組成員前期構(gòu)建完成和大鼠Β半乳糖苷酶基因重組腺病毒ADLACZ，由國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室姚航平副研究員贈(zèng)與，并測(cè)定其MOI值。2大鼠腎系膜細(xì)胞細(xì)胞株HBZY1培養(yǎng)HBZY1分5組培養(yǎng)，分別按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入處理因子。高糖ADLACZ病毒轉(zhuǎn)染組LACZ組DMEMH含葡萄糖4500MGL培養(yǎng)，ADLACZ以MOI50感染，轉(zhuǎn)染2小時(shí)后，更換不含病毒的培養(yǎng)液，為陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照組；高糖ADDCN病毒轉(zhuǎn)染組DCN組DMEMH含葡萄糖4500MGL培養(yǎng)，ADDCN以MOI50感染轉(zhuǎn)染，2小時(shí)后更換不含病毒的培養(yǎng)液，為目的基因轉(zhuǎn)染組；正常糖對(duì)照組N組DMEML含葡萄糖1000MGL培養(yǎng)，為正常對(duì)照組；高糖組H組DMEMH含葡萄糖4500MGL培養(yǎng)，為高糖對(duì)照組；高糖TGFΒ1中和抗體對(duì)照組HANTITGF組DMEMH含葡萄糖4500MGL培養(yǎng)，TGFΒ1中和抗體以3NGML的濃度中和，處理12小時(shí)換液。該組為陽(yáng)性對(duì)照組。在各種因子處理后培養(yǎng)5天。3MTT法測(cè)定系膜細(xì)胞的增殖在培養(yǎng)第1天各種因子處理后24小時(shí)，第2天，第3天，第4天，第5天，分別用MTT法測(cè)定各組系膜細(xì)胞的增殖情況。4WESTERNBLOT法檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)HBZY1按上述分組培養(yǎng)，在培養(yǎng)第1天各種因子處理后24小時(shí)，第2天，第3天，第4天，第5天，收集培養(yǎng)上清和提取大鼠腎系膜細(xì)胞的總蛋白，測(cè)定樣品蛋白總濃度，WESTERNBLOT法測(cè)定上清DCN蛋白含量，系膜細(xì)胞TGFΒ1，Ⅳ膠原COLLAGENⅣ，CⅣ，纖維連接蛋白FIBRONECTIN，F(xiàn)N和層粘連蛋白LAMMININ，LN蛋白含量。同時(shí)測(cè)定ΒACTIN蛋白作為內(nèi)參。膠片用EPSON公司的F3200型掃描儀掃描，輸入計(jì)算機(jī)。TOTALLABV2005軟件分析目的蛋白和ΒACTIN蛋白的凈光密度值。目的蛋白和ΒACTIN凈光密度的比值作為比較值。5統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS100軟件統(tǒng)計(jì)，兩樣本間2的比較T檢驗(yàn)，多個(gè)樣本間的比較用單因素方差分析，P＜005有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜001有顯著差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1高糖對(duì)系膜細(xì)胞的作用高糖促進(jìn)系膜細(xì)胞的增殖，增殖作用在培養(yǎng)第1天出現(xiàn)，持續(xù)整個(gè)實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)點(diǎn)。高糖促進(jìn)系膜細(xì)胞TGFΒ1合成和DCN分泌，其作用在第1天出現(xiàn)，持續(xù)整個(gè)實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)點(diǎn)。高糖增加ECM的合成，CⅣ合成增加在培養(yǎng)后24小時(shí)即出現(xiàn)，而FN、LN合成增加出現(xiàn)在第3天，均持續(xù)至第5天。2ADDCN對(duì)高糖環(huán)境下的系膜細(xì)胞的作用ADDCN抑制高糖引起的系膜細(xì)胞增殖，其抑制作用出現(xiàn)于第4，第5天，較TGFΒ1中和抗體抑制細(xì)胞增殖的作用出現(xiàn)在第1天的作用緩慢，但第5天時(shí)兩組的抑制作用相似P＞005。ADDCN轉(zhuǎn)染明顯增加系膜細(xì)胞培養(yǎng)上清中DCN蛋白含量。在培養(yǎng)第3天，培養(yǎng)上清中DCN含量顯著增加，分別是高糖組的141％和高糖LACZ組的134％，第5天培養(yǎng)上清中的DCN含量依然是5組中最高的，是高糖組的167％，是高糖LACZ組的143％。ADDCN轉(zhuǎn)染對(duì)系膜細(xì)胞TGFΒ1蛋白合成的抑制作用在轉(zhuǎn)染的第3天出現(xiàn)，持續(xù)至實(shí)驗(yàn)第5天；ADDCN對(duì)系膜細(xì)胞合成CⅣ，F(xiàn)N，LN的抑制作用在轉(zhuǎn)染的第3天出現(xiàn)，持續(xù)至第5天，與TGFΒ1中和抗體的抑制作用趨勢(shì)一致。在培養(yǎng)第5天，ADDCN轉(zhuǎn)染組、TGFΒ1中和抗體組和正常對(duì)照組間TGFΒ1、CⅣ、FN和LN的蛋白表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P＞005。3ADLACZ對(duì)高糖環(huán)境下的系膜細(xì)胞的作用實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染的第1天對(duì)系膜細(xì)胞有輕微促增殖作用，并持續(xù)整個(gè)實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)段，但與高糖組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。ADLACZ對(duì)系膜細(xì)胞DCN蛋白合成無(wú)顯著影響，與高糖組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。ADLACZ轉(zhuǎn)染后第1天可見(jiàn)系膜細(xì)胞TGFΒ1、CⅣ、FN和LN合成有輕度增加，與高糖組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P＜005，第3天，第5天這種影響已不明顯，與高糖組比較，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P＞005。結(jié)論1高糖促進(jìn)大鼠腎系膜細(xì)胞的增殖，促進(jìn)DCN、TGFΒ1、和細(xì)胞外基質(zhì)成分CⅣ、FN和LN蛋白合成。2但白聚糖Ⅱ重組腺病毒載體可在大鼠腎系膜細(xì)胞中高效表達(dá)目的蛋白DCN。3腺病毒介導(dǎo)的DCN基因轉(zhuǎn)染可明顯抑制高糖環(huán)境下大鼠腎系膜細(xì)胞的增殖，抑制高糖刺激的TGFΒ1，CⅣ，F(xiàn)N，LN蛋白的表達(dá)。其對(duì)大鼠系膜細(xì)胞增殖及TGFΒ1、CⅣ、FN和LN蛋白表達(dá)的抑制作用與TGFΒ1中和抗體相似。

簡(jiǎn)介：點(diǎn)擊查看更多噬菌體作指示病毒用于消毒效果評(píng)價(jià)的研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡(jiǎn)介：目的構(gòu)建ADAMTS5SIRNA慢病毒載體研究慢病毒載體介導(dǎo)的SIRNA對(duì)大鼠離體軟骨細(xì)胞中ADAMTS5基因表達(dá)的影響。方法針對(duì)ADAMTS5基因RNAI有效靶點(diǎn)構(gòu)建大鼠PGCSILGFPADAMTS5SIRNA表達(dá)質(zhì)粒使用慢病毒包裝系統(tǒng)在293T細(xì)胞中進(jìn)行包裝生產(chǎn)含ADAMTS5SIRNA的慢病毒顆粒然后轉(zhuǎn)導(dǎo)入大鼠軟骨細(xì)胞。通過(guò)REALTIMEPCR和WESTERNBLOT方法檢測(cè)轉(zhuǎn)導(dǎo)后軟骨細(xì)胞ADAMTS5基因MRNA及蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果成功包裝大鼠含ADAMTS5SIRNA慢病毒顆粒。ADAMTS5SIRNA能順利轉(zhuǎn)入軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染率為80％從REALTIMEPCR結(jié)果可以看出大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中ADAMTS5MRNA的表達(dá)量干擾組明顯低于陰性對(duì)照組差異有顯著性意義P結(jié)論利用慢病毒載體把ADAMTS5SIRNA轉(zhuǎn)入大鼠軟骨細(xì)胞使軟骨細(xì)胞的ADAMTS5基因沉默為進(jìn)一步闡明SIRNA沉默ADAMTS5基因防治骨關(guān)節(jié)炎的分子機(jī)制提供基礎(chǔ)。

簡(jiǎn)介：全球有超過(guò)5億人口屬于丙型肝炎病毒（HCV）和或乙型肝炎病毒（HBV）慢性感染人群，這些感染者有可能逐步發(fā)展為慢性肝炎、肝硬化和肝癌。因缺少理想的病毒感染體系而制約了病毒生活周期、先天免疫反應(yīng)以及發(fā)病機(jī)制的相關(guān)研究，從而阻礙了研發(fā)抗病毒藥物的進(jìn)程。盡管乙肝病毒的預(yù)防性疫苗早已上市，HCV疫苗卻還未研發(fā)成功。相比于其它大部分的病毒感染，HCV感染的主要特征是極易形成慢性感染（約80％）。另一方面，約有20的HCV感染者能夠自動(dòng)清除體內(nèi)病毒而不需要接受治療，表明宿主的先天免疫反應(yīng)可以控制病毒感染。在病毒感染過(guò)程中，誘導(dǎo)I型干擾素和干擾素刺激基因（ISGS）是宿主抵御病毒的主要方式。宿主通過(guò)模式識(shí)別受體（PRRS）捕獲病毒感染所形成的病原體相關(guān)分子模式（PAMPS），激活先天免疫應(yīng)答系統(tǒng)。主要的PRRS包括RIGI樣受體（RLRS）、TOLL樣受體（TLRS）、NOD樣受體（NLRS）和蛋白激酶R（PKR）。然而，HCV和肝細(xì)胞抗病毒先天免疫反應(yīng)之間的復(fù)雜相互作用機(jī)制未知。本研究工作旨在研發(fā)一個(gè)理想的HCV和HBV感染細(xì)胞培養(yǎng)體系，并基于此體系探究宿主應(yīng)答病毒感染的先天免疫機(jī)制。第一，成功分離了一株新型肝癌細(xì)胞系HLCZ01。該細(xì)胞系來(lái)源于一位患有高分化肝癌的男性病人的肝組織。HLCZ01細(xì)胞的形態(tài)酷似人正常原代肝細(xì)胞（PHH），并表達(dá)多種肝細(xì)胞特異性標(biāo)志物，包括白蛋白（ALB）、Α1抗胰蛋白酶（AAT）、肝細(xì)胞核因子4（HNF4）、細(xì)胞色素CYP3A4和MIR122。同時(shí)，HLCZ01細(xì)胞還表達(dá)HCV的四種受體，分別為CD81、SRBI、CLDN1和OCLN。第二，HLCZ01細(xì)胞系支持HCV和HBV感染的完整生活周期。HLCZ01細(xì)胞既支持實(shí)驗(yàn)室來(lái)源和臨床病人血清中的HCV感染和復(fù)制，又支持體外來(lái)源的和體內(nèi)病人血清來(lái)源的HBV感染和復(fù)制。從病毒感染的HLCZ01細(xì)胞中組裝和釋放的HBV和HCV可以再感染原始的HLCZ01細(xì)胞。HLCZ01細(xì)胞支持HBV和HCV共感染，并且這兩種肝炎病毒在HLCZ01細(xì)胞中的復(fù)制互不干擾?？笻BSAG和抗CD81特異性抗體可分別阻斷HBV和HCV入侵HLCZ01細(xì)胞。已開(kāi)發(fā)的抗病毒藥物可有效抑制HBV和HCV在HLCZ01細(xì)胞中的復(fù)制。HLCZ01是世界首例支持HBV和HCV病人血清直接感染以及HBVHCV共感染的肝癌細(xì)胞系，這株細(xì)胞系可應(yīng)用于肝炎病毒生活周期、肝細(xì)胞與肝炎病毒相互作用的研究以及抗病毒藥物和疫苗的研發(fā)。第三，HLCZ01細(xì)胞和PHH具有完整的先天免疫應(yīng)答系統(tǒng)。一方面，HCV感染肝細(xì)胞后可誘導(dǎo)IFNΒ和G1P3、ISG12A以及18U等抗病毒ISGS的表達(dá)。在HLCZ01細(xì)胞中，HBV的存在并不影響HCV誘導(dǎo)IFNΒ和ISGS的產(chǎn)生。另一方面，HCV感染HLCZ01細(xì)胞和PHH至相對(duì)較長(zhǎng)時(shí)間點(diǎn)時(shí)，可誘導(dǎo)病毒感染細(xì)胞凋亡，這可能是宿主細(xì)胞清除病毒的另一種先天免疫應(yīng)答方式。在肝細(xì)胞中沉默TRAIL可抑制HCV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。RIGI缺失可下調(diào)IFNΒ和TRAIL的表達(dá)，并阻斷病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)病毒復(fù)制。IRF3是RIGI的下游信號(hào)分子，同樣參與了TRAIL介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡。第四，MIR942通過(guò)調(diào)控ISG12A表達(dá)以介導(dǎo)HCV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。借助于HLCZ01細(xì)胞感染體系，找到了介導(dǎo)HCV所致細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控分子ISG12A及其參與HCV誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路。經(jīng)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證顯示，MIR942是ISG12A的負(fù)調(diào)控因子。HCV感染可下調(diào)MIR942的表達(dá)，并且MIR942與ISG12A在HCV感染的肝細(xì)胞和肝組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性。過(guò)表達(dá)或沉默MIR942可分別減弱或增強(qiáng)HCV誘導(dǎo)的細(xì)胞調(diào)亡。同時(shí)，促凋亡蛋白NOXA在HCV感染細(xì)胞中被誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)的NOXA可介導(dǎo)ISG12A依賴(lài)的肝細(xì)胞凋亡。綜上所述，本研究工作構(gòu)建了一株支持HCV和HBV完整生活周期的新型肝癌細(xì)胞系HLCZ01。借助于該感染體系，初步揭示了若干宿主應(yīng)答病毒感染的先天免疫反應(yīng)節(jié)點(diǎn)。RIGI通路在HCV感染誘導(dǎo)I型干擾素產(chǎn)生和引發(fā)TRAIL介導(dǎo)的病毒感染細(xì)胞凋亡途徑中起關(guān)鍵作用。MIR942通過(guò)調(diào)控ISG12A表達(dá)可介導(dǎo)NOXA依賴(lài)的HCV所致細(xì)胞凋亡。

簡(jiǎn)介：學(xué)校代碼10663學(xué)號(hào)4201210000215貴州師范大學(xué)碩士學(xué)位論文不同囤積行為水平大學(xué)生的認(rèn)知分類(lèi)實(shí)驗(yàn)研究EXPERIMENTALRESEARCHONCOGNITIVECATEGIZATIONINCOLLEGESTUDENTSWITHDIFFERENTHOARDINGBEHAVILEVEL專(zhuān)業(yè)名稱(chēng)發(fā)展與教育心理學(xué)專(zhuān)業(yè)代碼040202研究方向認(rèn)知發(fā)展與教育申請(qǐng)人姓名劉濛導(dǎo)師姓名傅麗萍二零一五年三月二十日目錄摘要IABSTRACTIII引言1第一部分文獻(xiàn)綜述31囤積行為32認(rèn)知分類(lèi)的研究及其理論63有關(guān)囤積行為者的認(rèn)知分類(lèi)能力研究9第二部分問(wèn)題提出與研究假設(shè)151問(wèn)題提出152研究意義1521理論意義1622實(shí)踐意義163研究假設(shè)16第三部分實(shí)驗(yàn)研究18實(shí)驗(yàn)一囤積行為大學(xué)生的認(rèn)知分類(lèi)能力特點(diǎn)研究181實(shí)驗(yàn)?zāi)康?82實(shí)驗(yàn)方法183實(shí)驗(yàn)結(jié)果214分析與討論245結(jié)論26

簡(jiǎn)介：目的丙型肝炎病毒HCV感染是慢性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌的主要原因，已成為全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題。HCV5端非編碼區(qū)5NCR含內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)IRES，以非帽依賴(lài)機(jī)制介導(dǎo)著HCV基因翻譯，且堿基序列高度保守，因此HCV5NCR是抗HCV藥物篩選的主要靶位點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)旨在構(gòu)建一系列含有HCV5NCR5端梯度缺失序列調(diào)控螢火蟲(chóng)熒光素酶LUC報(bào)告基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，以分析影響HCV5NCR的翻譯啟動(dòng)活性的功能序列，為進(jìn)一步研究HCVIRES的結(jié)構(gòu)與功能提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。方法以PCMVNCRLUC以下簡(jiǎn)稱(chēng)PCNI為模板，PCR擴(kuò)增獲得一系列HCV5NCR5’端梯度缺失序列，然后利用基因重組技術(shù)，用這些序列分別替換PCNI中的完整HCV5NCR，構(gòu)建HCV5NCR5，端梯度缺失序列調(diào)控LUC的真核表達(dá)質(zhì)粒PCNLD1、PCNLD2、PCNLD3、PCNID4；同時(shí)。PCR擴(kuò)增缺失所有HCV序列的模板片段，構(gòu)建無(wú)HCV5NCR片段的LUC真核表達(dá)質(zhì)粒PCNID5；各重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和DNA測(cè)序鑒定；用脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將上述重組質(zhì)粒及PCNL轉(zhuǎn)染至人肝癌細(xì)胞株HEPG2；轉(zhuǎn)染后48H用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶相對(duì)活性以分析5NCR5端梯度缺失序列對(duì)LUC基因的調(diào)控作用，并經(jīng)RTPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中LUC基因的相對(duì)表達(dá)水平觀察LUC基因在轉(zhuǎn)錄水平有無(wú)不同。結(jié)果PCR擴(kuò)增分別獲得5端缺失NTL20NTL43NTL118和NTL330的HCV5NCR片段，及缺失所有HCV序列的模板片段；經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定表明HCV5NCR5端梯度缺失序列調(diào)控LUC的真核表達(dá)質(zhì)粒PCNLDL、PCNLD2、PCNID3、PCNLD4和無(wú)HCV5NCR片段的LUC真核表達(dá)質(zhì)粒PCNLD5構(gòu)建成功；各重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后LUCMRNA的相對(duì)表達(dá)水平與PCNL相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P005PCNLD1、PCNLD2表達(dá)的熒光素酶活性與PCNL差異無(wú)顯著性P005，PCNLD3與PCNLD4的熒光素酶活性與空白對(duì)照差異無(wú)顯著性P005，PCNLD5的熒光素酶相對(duì)表達(dá)活性為PCNL的70％。結(jié)論成功構(gòu)建了由HCV5NCR5’端梯度缺失序列調(diào)控LUC表達(dá)的質(zhì)粒PCNLDL、PCNLD2、PCNLD3、PCNLD4和無(wú)HCV5NCR片段的LUC真核表達(dá)質(zhì)粒PCNLD5；在本實(shí)驗(yàn)條件下，HCV5NCRNT44407序列具有全部翻譯啟動(dòng)活性，NT44118結(jié)構(gòu)域II含有影響HCVIRES翻譯啟動(dòng)活性的關(guān)鍵序列。

簡(jiǎn)介：第一部分人MXA基因重組真核載體的構(gòu)建及鑒定目的在前期獲得含有目的基因MXA的PADTRACKMXA含MXA的重組腺病毒穿梭質(zhì)?；A(chǔ)上，應(yīng)用真核載體PCDNA31構(gòu)建重組真核載體PCDNA31MXA。方法在大腸桿菌JM109中擴(kuò)增獲得含有目的基因MXA的PADTRACKMXA和PCDNA31，使用兩者共同的限制性?xún)?nèi)切酶XBAⅠ、NOTⅠ進(jìn)行雙酶切，并連接以構(gòu)建重組真核載體PCDNA31MXA，然后通過(guò)氨芐青霉素抗性篩選，雙酶切及PCR鑒定，選取鑒定正確的克隆測(cè)序，并應(yīng)用DNASSIST20軟件對(duì)序列與前期獲得的基因序列以及已知GENBANK中MXA基因序列進(jìn)行同源性分析。結(jié)果經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶、PCR鑒定重組真核載體PCDNA31MXA構(gòu)建成功。測(cè)序結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)所克隆片段長(zhǎng)2012BP，包含人MXA基因序列，核苷酸序列分析表明與前期獲得的目的基因序列完全相同，而與GENBANK中人MXA基因序列同源性也達(dá)9975％，僅有5個(gè)堿基不同，且所編碼的氨基酸僅1個(gè)發(fā)生改變，此氨基酸位于MXA蛋白的非功能區(qū)。結(jié)論重組真核載體PCDNA31MXA構(gòu)建成功，為下一步研究重慶市衛(wèi)生局資助項(xiàng)目編號(hào)03125MXA抗乙型肝炎病毒作用奠定了基礎(chǔ)。第二部分人MXA基因重組真核載體抗乙型肝炎病毒作用的實(shí)驗(yàn)室研究目的體外研究PCDNA31MXA體外抗HBV的作用，為進(jìn)一步研究體內(nèi)抗病毒及臨床應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法將構(gòu)建成功的重組真核載體PCDNA31MXA轉(zhuǎn)染入HEPG2215，根據(jù)PCDNA31MXA新霉素抗性，使用G418抗性篩選出穩(wěn)定的細(xì)胞克隆。將HEPG2215分為實(shí)驗(yàn)組穩(wěn)定表達(dá)PCDNA31MXA的HEPG2215和對(duì)照組未轉(zhuǎn)染組，應(yīng)用RTPCR方法檢測(cè)兩組HEPG2215內(nèi)MXAMRNA水平的表達(dá)，并應(yīng)用ELISA法檢測(cè)兩組HEPG2215內(nèi)HBSAG、HBEAG的水平。結(jié)果經(jīng)濃度梯度篩選顯示G418最適篩選濃度為600ΜGML，并在培養(yǎng)第3周篩選出穩(wěn)定表達(dá)PCDNA31MXA的HEPG2215。RTPCR擴(kuò)增結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組的MXAMRNA水平均較對(duì)照組明顯升高，而且ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組HBSAG、HBEAG水平明顯低于對(duì)照組，其結(jié)果具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P001。結(jié)論在HEPG2215內(nèi)成功轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達(dá)重組真核載體PCDNA31MXA，PCDNA31MXA能抑制HEPG2215中HBV的復(fù)制及表達(dá)。

簡(jiǎn)介：復(fù)旦大學(xué)博士學(xué)位論文慢病毒介導(dǎo)的SURVIVIN基因穩(wěn)定干擾對(duì)PC3細(xì)胞株體內(nèi)外生長(zhǎng)的影響姓名陳智新申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別博士專(zhuān)業(yè)泌尿外科指導(dǎo)教師丁強(qiáng)20070401復(fù)旦大學(xué)博士研究生畢業(yè)論文中文摘要中文摘要第一部分SURVIVIN基因穩(wěn)定干擾PC3細(xì)胞系的建立目的構(gòu)建SURVIVIN基因穩(wěn)定干擾的PC3細(xì)胞系方法設(shè)計(jì)針對(duì)SURVIVIN基因的SHRNA序列，構(gòu)建SURVIVINSHRNA慢病毒載體并感染PC3細(xì)胞，采用RTPCR和流式細(xì)胞技術(shù)分別檢測(cè)SURVIVINMRNA和蛋白表達(dá)水平，并與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組PC3細(xì)胞比較。結(jié)果SURVIVINSHRNA慢病毒載體感染PC3細(xì)胞后SURVIVINMRNA和蛋白水平分別為589X012％和1182032％，明顯低于陰性對(duì)照組5517士087％、9570A156％和空白對(duì)照PC3細(xì)胞58212068％、9590A178％結(jié)論采用SHRNA慢病毒載體成功構(gòu)建了SURVIVIN基因穩(wěn)定干擾的PC3細(xì)胞系。I關(guān)鍵詞L慢病毒；RN舡；前列腺癌；PC3SURVIVIN第二部分SURVIVIN基因穩(wěn)定干擾對(duì)PC3細(xì)胞的生長(zhǎng)及凋亡的情況目的研究SURVIVIN基因穩(wěn)定干擾對(duì)PC3細(xì)胞凋亡及生長(zhǎng)的影響。方法對(duì)PC3細(xì)胞、PC3／C細(xì)胞、PC3／I細(xì)胞分別行WESTERNBLOT檢測(cè)CASPASE3蛋白質(zhì)表達(dá)水平；流式細(xì)胞學(xué)檢查各組細(xì)胞凋亡水平；細(xì)胞計(jì)數(shù)比較各組細(xì)胞生長(zhǎng)。結(jié)果各組細(xì)胞CASPASE3的相對(duì)表達(dá)量分別為PC3細(xì)胞組O21020021、PC3／C細(xì)胞組O240X0019、PC3／I組O574士O041；PC3細(xì)胞組和PC3，C細(xì)胞組凋亡比率分別為23％和26％、PC3／I細(xì)胞組凋亡比率為225％；PC31I細(xì)胞生長(zhǎng)明顯慢于PC3和PC3／I細(xì)胞。結(jié)論慢病毒介導(dǎo)的SURVIVIN基因穩(wěn)定干擾能在體外促進(jìn)PC3細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)?！娟P(guān)鍵詞L崽岍掏BRNA干擾；PD鉀咄叫塒M激素非依賴(lài)前列腺癌第三部分SURVIVIN基因穩(wěn)定干擾對(duì)PC3裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響

簡(jiǎn)介：目的構(gòu)建含人SCL基因的PDC315SCL重組腺病毒載體為下一步研究SCL基因在ICC樣細(xì)胞的功能奠定基礎(chǔ)。方法從含有人SCL基因的質(zhì)粒中，采用PCR方法擴(kuò)增SCL基因，將目的載體PDC315EGFP進(jìn)行酶切后交換，其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)克隆產(chǎn)物進(jìn)行菌落PCR鑒定，對(duì)陽(yáng)性克隆產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序和比對(duì)分析，比對(duì)正確的克隆即為構(gòu)建成功的重組穿梭質(zhì)粒。PDC315EGFPSCL在脂質(zhì)體介導(dǎo)下與腺病毒輔助大質(zhì)粒PBHGLOXDELTAE13CRE共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，包裝產(chǎn)生復(fù)制缺陷型重組腺病毒PDC315SCL經(jīng)HEK293細(xì)胞擴(kuò)增，純化后測(cè)定病毒滴度。通過(guò)觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)評(píng)估重組腺病毒對(duì)CAJAL樣間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率。結(jié)果PCR擴(kuò)增的SCL基因片段長(zhǎng)度為1036BP，測(cè)序結(jié)果以及重組質(zhì)粒PDC315EGFPSCL陽(yáng)性克隆凝膠電泳鑒定均證明SCL基因成功克隆到腺病毒穿梭質(zhì)粒真核表達(dá)載體中。PDC315SCL重組腺病毒載體通過(guò)PCR結(jié)果證明和WESTERNBLOT檢測(cè)證實(shí)PDC315SCL重組腺病毒載體構(gòu)建成功，滴度達(dá)到11010PFUML，對(duì)膀胱CAJAL樣間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率可達(dá)95。結(jié)論成功構(gòu)建了含人SCL基因真核表達(dá)載體PDC315EGFPSCL和應(yīng)用ADMAX載體系統(tǒng)成功構(gòu)建含人SCL基因重組腺病毒載體PDC315SCL。PDC315SCL重組腺病毒載體對(duì)CAJAL樣間質(zhì)細(xì)胞有很高的轉(zhuǎn)染效率。

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