兩種富血小板纖維蛋白對人牙齦成纖維細胞的生長速度及質量影響的實驗研究.pdf

1、目的：
　　通過實驗，對比兩種富血小板纖維蛋白,即改良型富血小板纖維蛋白（Advanced Platelet-Rich Fibrin,A-PRF)和富血小板纖維蛋白（Platelet-Rich Fibrin,PRF），與人牙齦成纖維細胞共同培養(yǎng)后對其生長速度及質量的影響，分析自體血液通過不同離心參數所得的兩種生物材料各自在影響牙齦生長過程中的特點，為臨床中選擇對口腔局部軟組織缺損再生修復和重塑材料，提供參考。
　　方法：

2、r>　　1.人牙齦成纖維細胞的獲得、培養(yǎng)及鑒定：臨床上收集8例下頜阻生智齒患者拔牙時切取的齦瓣，以MEM培養(yǎng)基進行組織塊培養(yǎng)，取第三代細胞進行鼠抗人 Vimentin單抗、鼠抗人cytokeratin單抗染色,鑒定是否為成纖維細胞。當原代細胞生長至80~90％融合時，開始進行傳代。
　　2.制備PRF及A-PRF膜：抽取對應的牙齦提供者的肘靜脈血每管5ml，以1500rpm，14min和2700rpm，12min分別離心獲得A-P

3、RF及PRF凝膠，專用工具盒壓制成膜，縱向對稱裁剪成4等份，稱重，修剪至質量相等。
　　3.A-PRF膜、PRF膜與細胞進行共同培養(yǎng)：實驗設置分為A-PRF組、PRF組、空白組，同時調節(jié)細胞濃度為3×104個/ml，A-PRF組平鋪A-PRF膜于培養(yǎng)板底部，PRF組平鋪PRF膜于培養(yǎng)板底部，三組分別加入1000ul細胞懸液。
　　4.于細胞加入后的1、3、5、7天，三組分別進行CCK-8檢測，測定細胞增殖活性。
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4、.于細胞加入后的1、3、5、7天，三組分別進行I型膠原纖維（COL1A1）的PCR檢測。
　　6.于細胞加入后的1、3、5、7天，A-PRF組與PRF組分別進行掃描電鏡檢測。
　　7.統計學分析CCK-8結果，PCR檢測結果。
　　結果：
　　1.細胞培養(yǎng)：8組標本均順利取材培養(yǎng)，無污染，組織塊培養(yǎng)第7天，于倒置相差顯微鏡下見部分組織塊周圍有細胞游離，呈梭形，胞體豐滿邊界清晰；第15天，可見組織塊周圍大量細胞密集

5、布滿，呈放射狀，層疊狀，較規(guī)律，胞體豐滿邊界清晰。
　　2.細胞鑒定：取第三代細胞進行鑒定，8例標本全部對抗 Vimentin染色陽性，細胞核染為藍色，胞漿染為棕色。8例標本對抗cytokeratin染色陰性，細胞核染為藍色，胞漿不著色，表明細胞為間充質來源細胞。
　　3.CCK-8計數：第1天，三組之間對比均無統計學意義（P＞0.05）。第3天，A-PRF組與PRF組對比，有統計學意義（P＜0.05），兩組分別與空白組對照

6、，均有統計學意義（P＜0.05）。第5天，A-PRF組與PRF組對比，有統計學意義（P＜0.05），A-PRF組與空白組對照有顯著統計學意義（P＜0.01），PRF組與空白組對照，有統計學意義（P＜0.05）。第7天，A-PRF組與空白組對照有統計學意義（P＜0.05），PRF組與空白組對照，有顯著統計學意義（P＜0.01），A-PRF組與PRF組之間對比無統計學意義（P＞0.05）。
　　4.PCR檢測Ⅰ型膠原纖維：第1天，三組

7、之間無統計學差異（P＞0.05）；第3天，A-PRF組相對于PRF組有統計學意義（P＜0.05），A-PRF組與PRF組相對于空白組皆有統計學意義（P＜0.05），且A-PRF組共同培養(yǎng)與空白組對比，有顯著統計學意義（P＜0.01）；第5天，A-PRF組相對于PRF組和空白組皆有統計學意義（P＜0.05），PRF組相對于空白組無統計學意義（P＞0.05）；第7天，A-PRF組相對于PRF組和空白組皆有統計學意義（P＜0.05），PRF組

8、相對于空白組無統計學意義（P＞0.05）， A-PRF組與空白組對比，有顯著統計學意義（P＜0.01）。
　　5.掃描電鏡觀察：接種后第一天，可見完整A-PRF和PRF膜，其中A-PRF膜纖維蛋白呈粗大條索狀交織，PRF膜纖維蛋白呈細密網絡狀交織，排列規(guī)則整齊，對比觀察，可見 A-PRF膜纖維蛋白更加粗大褶皺， PRF膜纖維蛋白細密平整，接種的成纖維細胞散落在網中，胞體呈圓形邊界清晰，未見明顯黏附痕跡，網絡間還可見少量紅細胞嵌入。

9、接種后第三天，A-PRF膜粗大纖維結構仍清晰且較規(guī)律，PRF膜不再致密平整，變得開始凹凸不平。網狀結構中少量成纖維細胞黏附，形態(tài)不再為圓形，形態(tài)扁平且變長，逐漸貼附于纖維蛋白表面。接種后第五天，A-PRF膜表面變得粗糙，仍可隱約見纖維蛋白條索輪廓，PRF膜較第三天更加粗糙，可見小縫隙。成纖維細胞密度變大，呈梭形或星形，伸出偽足，緊密貼附于纖維蛋白，有的可見偽足深入縫隙之中。接種后第七天，A-PRF膜條索輪廓基本消失，但仍舊有完整結構，纖

10、維蛋白仍細密交織成網，PRF膜出現缺損。A-PRF和PRF膜表面都大量黏附成纖維細胞，梭形，偽足嵌入網中，貼附緊密。
　　結論：
　　1.成纖維細胞培養(yǎng)鑒定結果所示，所得細胞均為實驗目標細胞，即成纖維細胞，該實驗方法可行。
　　2.A-PRF、PRF均能提高成纖維細胞增殖活性，且在3-5天促進作用最為明顯，A-PRF總體促進效果優(yōu)于PRF。
　　3.在創(chuàng)傷愈合早期（術后7天內），A-PRF促進膠原纖維沉積的能力優(yōu)