Bufalin對(duì)人食管癌細(xì)胞ERK-P-ERK和細(xì)胞遷移能力的影響.pdf

1、食管癌是人類常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生是多因素作用、多基因參與、多階段共同發(fā)展的疾病，然而其發(fā)生發(fā)展的確切機(jī)制尚不明確。我國(guó)是世界上食管癌死亡率最高的國(guó)家之一，每年有不少人死于食管癌。由于其早期癥狀不明顯，不易察覺，到確診時(shí)已屬中晚期，故預(yù)后較差。盡管近些年來通過普查使得食管癌早發(fā)現(xiàn)早診斷早治療的水平有所提高，食管癌的預(yù)后有所改善，但五年生存率仍較低。因此，繼續(xù)尋找新的抗腫瘤藥物，并了解其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路成為食管癌

2、臨床治療研究的重點(diǎn)。
　　 本實(shí)驗(yàn)主要研究了ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，即Ras-Raf-MEK-ERK三級(jí)酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并通過轉(zhuǎn)染高活性MEK質(zhì)粒來研究食管癌細(xì)胞中ERK/p-ERK及細(xì)胞遷移能力的變化，進(jìn)而得知高活性MEK質(zhì)粒對(duì)人食管癌細(xì)胞中ERK信號(hào)通路的生物學(xué)作用，通過使用Bufalin（即蟾蜍靈，是從中華大蟾蜍或黑眶蟾蜍的耳后腺及皮膚腺的干燥分泌物提取的主要活性成分之一，屬于一種強(qiáng)心苷類物質(zhì)，已被用來作為一種傳統(tǒng)的中醫(yī)治療感染

3、、腫瘤以及麻醉）來有效的阻斷通路信號(hào)的異常傳導(dǎo)，降低各個(gè)因子的活化水平，從而達(dá)到抑制腫瘤因子異常增殖和遷移的作用。Bufalin在臨床上多有報(bào)道，但尚未應(yīng)用于食管癌的治療，本實(shí)驗(yàn)室的前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Bufalin可通過ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來下調(diào)細(xì)胞內(nèi)p-Raf、p-MEK、p-ERK的水平，而Raf、MEK、ERK則無明顯變化，提示Bufalin可能通過抑制ERK通路中各個(gè)因子的活化達(dá)到抑制食管癌發(fā)生發(fā)展的作用。本實(shí)驗(yàn)就此在Bufalin對(duì)

4、人食管癌細(xì)胞中ERK/p-ERK和細(xì)胞遷移能力的影響方面進(jìn)行研究，從而多方面驗(yàn)證Bufalin在食管癌中的作用，為臨床能夠更好的治療食管癌提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)與新的治療方向。
　　 為了更好的研究食管癌發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制以及治療食管癌的方案，本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)使用了食管癌細(xì)胞株TE13進(jìn)行人體外的研究，旨為了解在食管癌發(fā)生發(fā)展過程中Bufalin在ERK通路中所發(fā)揮的具體作用，并為更好的服務(wù)于臨床打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　 目的:探討

5、Bufalin對(duì)人食管癌細(xì)胞ERK/p-ERK和細(xì)胞遷移能力的影響
　　 方法:
　　 1將攜帶高活性MEK基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌中進(jìn)行擴(kuò)增，并使用脂質(zhì)體法將攜帶高活性MEK基因的質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染到食管癌TE13細(xì)胞中，使用WesternBlot方法分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒0h、24h、30h、36h、42h、48h后細(xì)胞內(nèi)ERK表達(dá)及其活化情況的變化，并得出轉(zhuǎn)染的最佳時(shí)間。
　　 2用WesternBlot方法分

6、別檢測(cè)不同處理組（對(duì)照組、空載體轉(zhuǎn)染組、高活性MEK質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染后加Bufalin組）中細(xì)胞內(nèi)ERK及其活化情況的蛋白表達(dá)，進(jìn)而研究轉(zhuǎn)染高活性MEK質(zhì)粒及Bufalin對(duì)ERK通路的影響。
　　 3采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)分別測(cè)量不同處理組（普通培養(yǎng)組、空載體轉(zhuǎn)染組、高活性MEK質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染后加Bufalin組、轉(zhuǎn)染后加Uo126組、Bufalin和Uo126聯(lián)合應(yīng)用組）36h后細(xì)胞遷移的距離，并與對(duì)照組作比較，進(jìn)而研究不同處理

7、組對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1成功將高活性MEK質(zhì)粒擴(kuò)增并轉(zhuǎn)染到食管癌細(xì)胞中，并檢測(cè)到其下游基因ERK在不同處理組間蛋白水平無明顯變化(0.542±0.015，0.687±0.020,0.576±0.019,0.579±0.016,0.475±0.011,0.611±0.006，P＞0.05)，無顯著性差異。而p-ERK在對(duì)照組和空載體組中亦無明顯變化，但在高活性MEK質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中的活化水平明顯升高，且

8、隨轉(zhuǎn)染后時(shí)間的增加(0h、24h、30h、36h)表達(dá)量逐漸升高，至36小時(shí)達(dá)到最高值，此后(42h、48h)表達(dá)量開始下降(0.756±0.035，0.663±0.040，0.714±0.053，1.314±0.053，0.663±0.034，0.704±0.009，P＜0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2WesternBlot結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染高活性MEK質(zhì)粒36h后，ERK蛋白的表達(dá)在不同處理組間無明顯差別(0.800±

9、0.003，0.714±0.034，0.759±0.022，0.750±0.026，P＞0.05)，而ERK的活化水平p-ERK在轉(zhuǎn)染組的表達(dá)明顯高于對(duì)照組和空載體組，當(dāng)轉(zhuǎn)染后加入Bufalin后，p-ERK的水平又受到抑制，明顯下降(0.381±0.026，0.400±0.017，0.698±0.010，0.432±0.007，P＜0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:不同的處理組在劃痕36h后與對(duì)照組相

10、比遷移的距離不同，在高活性MEK質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組明顯大于其他各組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而Bufalin和Uo126聯(lián)合應(yīng)用組細(xì)胞遷移的距離又明顯低于單純應(yīng)用Bufalin和Uo126組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，Bufalin組和Uo126組差異不明顯(P＞0.05)(4.100±0.200，4.200±0.265，10.333±0.252,6.683±0.058,7.033±0.158,3.933±0.153)。<

11、br>　　 結(jié)論:
　　 1直接轉(zhuǎn)染高活性的MEK質(zhì)?？蛇M(jìn)一步激活其下游的ERK，使p-ERK的水平升高，且在轉(zhuǎn)染后36h時(shí)活化水平達(dá)到最高值。而ERK的表達(dá)并不受轉(zhuǎn)染時(shí)間的影響。
　　 2轉(zhuǎn)染高活性MEK質(zhì)?？梢允辜?xì)胞內(nèi)p-ERK的水平明顯升高，加入Bufalin后又可以顯著抑制ERK的活化，使p-ERK的水平又降低。而ERK的表達(dá)在不同處理組間無明顯變化。
　　 3Bufalin對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌TE13細(xì)胞