細胞色素P450酶活性評價的體外“cocktail”高通量篩選模型的建立和應用.pdf

1、細胞色素P450(CYPs)為存在于肝臟微粒體混合功能氧化酶系的主要成分，是一組由許多同工酶組成的超基因大家族，對許多內源、外源性化合物在體內的Ⅰ相生物轉化有重要作用。其中6種重要的CYPs亞型：CYP1A2(占總CYP藥物代謝的4﹪)、CYP2C9(10﹪)、CYP2C19(2﹪)、CYP2D6(30﹪)、CYP2E1(2﹪)、CYP3A4(50﹪)參與了90﹪的臨床藥物的代謝。臨床上兩種或兩種以上的藥物同時或前后序貫用藥時，在代謝環(huán)

2、節(jié)產(chǎn)生作用的干擾，結果使療效增強甚至產(chǎn)生毒副作用，或療效減弱甚至失敗。這種代謝性藥物相互作用96﹪是由CYPs介導的， 其中酶抑制引起的藥物相互作用約占全部的70﹪，酶誘導引起的占23﹪，其他類型占7﹪。所以在新藥的研發(fā)過程中，確定哪些CYPs亞型參與了先導候選藥的代謝，以及藥物對CYPs的影響(誘導或抑制)是十分重要的一個步驟，這些信息能夠幫助預測藥物臨床使用時的藥物相互作用。研究藥物的相互作用的方法有體外方法、體內方法，計算機模擬

3、方法。作為早期的篩選研究，體外方法顯得尤為重要，最常用的模型是利用人肝微粒體，評價藥物對探針代謝情況的影響。 傳統(tǒng)的方法在評價藥物的抑制作用時，一次只能評價一種亞型。如果要完成上述6個主要亞型的研究，將是一個費時、費力、費錢的大工程。隨著組合化學技術的發(fā)展，大量的先導化合物被開發(fā)出來，要完成這些物質的早期測評，傳統(tǒng)的方法顯然不能滿足要求，這就需要建立可信、便捷的高通量篩選的方法。因此人們嘗試同時給予多種探針藥物，即“cockta

4、il”法，來獲取多個代謝酶的表型信息?！癙ittsburgh cocktail”、“Cooperstown cocktail”、“Greenford-Ware cocktail”等是經(jīng)典的 in vivo“cocktail”方法。近年來，Samuel等、Zhang等、Bu等、Unger等、Dierks等都分別獨立建立了各自的體外cocktail方法：在人肝微粒體中，同時孵育探針的混合物，然后定量分析這些探針的代謝物的生成情況，以此來反映

5、藥物對CYPs的影響。體外cocktail方法的成功，很大程度上也依賴于能夠快速、同時檢測這些代謝物的分析方法。而現(xiàn)代的液質聯(lián)用(LC/MS/MS)技術，以其高度的敏感性和選擇性是滿足上述要求的不二人選。 近年來，中藥以其獨特的療效、不良反應少等優(yōu)點，在世界特別是歐美國家的應用越來越廣泛。中藥和處方藥合用的現(xiàn)象也更加普遍，因此使得中藥-藥物之間相互作用的幾率也增大，如丹參、大蒜、銀杏、枸杞子、木瓜、芒果能增加抗凝藥華法林的效應，

6、而酸果蔓汁、綠茶、大豆、圣約翰草則能降低它的抗凝效果；由此引發(fā)的胃腸道和心包出血所造成的死亡案例也有報道。這些相互作用不良反應中，尤其是中藥對細胞色素P450酶的影響所造成的占了很大的比例。應用各種方法，已經(jīng)證明許多中藥的活性成分是CYPs的底物、抑制劑或誘導劑。 在中藥的現(xiàn)代化進程中，對活性成分即單體的研究、開發(fā)和利用是重要的方面。但面對成千上萬種中藥單體，必須建立一種高通量篩選的方法，也就是上述的cocktail方法，來研究

7、它們對CYPs的影響從而預測可能存在的藥物相互作用。 雖然西方的大型制藥公司已經(jīng)廣泛的應用cocktail方法來對大量的先導化合物進行體外抑制篩選，但對于我國的中藥單體的高通量篩選工作至今未見報道。所以本課題的目的是要建立自己的“cocktai”1方法，并對多種萜類、黃酮類中藥單體進行體外抑制篩選，并對有陽性結果的代表性中藥單體進行體內試驗?？偣卜譃橐韵挛鍌€部分。 第一部分 人肝微粒體中6種探針代謝物的LC/MS/MS

8、分析方法的建立 目的：建立人肝微粒體中撲熱息痛、4-羥基甲苯磺丁脲、5-羥基奧美拉唑、氧去甲基右美沙芬、6-羥基氯唑沙宗、氧化硝苯地平以及內標檢測的質譜方法、液相方法及血漿樣本的萃取方法。 結論：建立了LC/MS/MS方法檢測人肝微粒體中撲熱息痛、4-羥基甲苯磺丁脲、5-羥基奧美拉唑、氧去甲基右美沙芬、6-羥基氯唑沙宗、氧化硝苯地平以及內標的濃度，方法精密度、準確度好，靈敏度高，適用于后續(xù)研究。 第二部分 人肝

9、微粒體體外“COCktail”模型的建立與驗證 目的：建立人肝微粒體的體外孵育體系；比較探針在“individual”和“cocktail”模型中的各種代謝行為，以驗證“cocktail”模型的準確可行。 結論：建立了優(yōu)化的人肝微粒體的體外孵育體系；探針在在“individual”和“cocktail”模型中的酶動力學參數(shù)相近，特異性抑制劑在“individual”和“cocktail”模型中IC<,50>值也相似，證明

10、“cocktail”模型準確可行，為后續(xù)的中藥單體高通量篩選奠定了基礎。 第三部分 應用體外“cocktail”模型進行萜類中藥單體的高通量抑制篩選 目的：應用體外“cocktail”模型第對20種萜類中藥單體進行篩選，分析它們對CYPs各個亞型的抑制作用。對于陽性結果進行后續(xù)試驗。 結論：體外cocktail法被成功的用于對20種萜類中藥單體的篩選，篩選出了丹參酮ⅡA、隱丹參酮、青蒿素、甘草次酸這四種體外抑制

11、能力比較強的萜類中藥單體，提示有可能會引起藥物的相互作用，需要進一步的體內試驗來驗證。“二步法”篩選策略也被證實是一個可靠，高效的方法。 第四部分 應用體外“COCktail”模型進行黃酮類中藥單體的高通量抑制篩選 目的：應用體外“cocktail”模型對32種不同類別的黃酮類中藥單體進行篩選，明確它們對CYPs各個亞型的抑制作用。對于陽性結果進行后續(xù)試驗。方 結論： 1. 黃酮類中藥單體對CYPs各個

12、亞型普遍存在著不同程度的抑制，提示有可能會引起藥物的相互作用，需要進一步的體內試驗來驗證。 2. 黃酮類化合物抑制CYP1A2的能力和結構之間存在明顯的構效關系，和黃酮類的生物活性也存在類似關系，可以為新化合物的設計提供思路。 第五部分 丹參酮ⅡA、槲皮素、山萘酚、蘆丁對大鼠肝微粒體細胞色素P450酶的基因表達、蛋白表達和活性的影響 目的：考察丹參酮ⅡA、槲皮素、山萘酚、蘆丁對大鼠肝微粒體細胞色素P450酶的基因