骨保護素基因治療抑制類風濕關節(jié)炎軟骨破壞的實驗研究.pdf

1、類風濕關節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一種病因未明，以反復發(fā)作的慢性小關節(jié)炎為主的疾病，其特征為關節(jié)滑膜增生以及關節(jié)軟骨與軟骨下骨的破壞。導致患者關節(jié)畸形、功能喪失以致生活能力下降的主要因素是軟骨和骨的破壞。目前尚無有效抑制該進程的方法。
　　在骨關節(jié)炎動物模型中觀察到，骨保護素(Osteoproegein，OPG)可以有效抑制軟骨和軟骨下骨的破壞。在佐劑誘導關節(jié)炎動物模型（Adjuvant-induce

2、darthritis，AIA）中也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)OPG治療的大鼠膝關節(jié)軟骨組織得到近乎完全保護。但是有報道指出膠原誘導的關節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)相對于AIA，其關節(jié)破壞更明顯，更加接近于RA軟骨的破壞。所以OPG對RA關節(jié)炎軟骨的作用尚需進一步研究。而且，OPG抑制關節(jié)炎軟骨破壞的病理機制尚未明了。
　　軟骨基質主要由纖維狀的膠原蛋白網(wǎng)絡和聚集的蛋白聚糖組成。軟骨細胞是唯一的細胞成分，負責調

3、節(jié)軟骨的代謝。正常情況下，軟骨細胞產(chǎn)生軟骨基質。分泌多種因子，并在局部達到平衡，以調節(jié)軟骨的新陳代謝和軟骨基質的平衡。簡言之，分解代謝因子，如基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-1、3、9、13或解聚素和金屬蛋白酶與血小板反應蛋白基序(a disintegrin andmetalloproteinase with thrombospondin motifs，ADAMTS)-4，5可降解軟骨的基質，

4、而TIMP-1、2、3、4，IGF-Ⅰ，TGF-β，BMP-2，bFGF等可以促進軟骨基質合成，從而抑制MMPs等的作用，進而達到平衡，以保持軟骨的自我更新。超負荷的壓力或者炎癥因子如IL-1，TNF-α等刺激可能打破軟骨代謝的平衡，從而導致軟骨基質降解和破壞。
　　研究顯示RA患者軟骨破壞的主要原因是增生的滑膜和炎癥細胞的侵蝕，但是至今并無能同時抑制滑膜炎癥和軟骨破壞的藥物。從軟骨破壞的內在機制，如軟骨細胞凋亡和蛋白多糖丟失著手

5、進一步探索，可能具有重大的臨床意義。Kim等人發(fā)現(xiàn)，在RA患者關節(jié)軟骨細胞較非RA患者軟骨細胞的凋亡率顯著增加。并且凋亡因子caspase3的表達在RA患者及動物模型的軟骨中均明顯增加。此外，通過番紅O染色評估發(fā)現(xiàn)在CIA模型動物中蛋白聚糖丟失更為顯著。表層的蛋白聚糖丟失通常是關節(jié)軟骨破壞的第一步，在蛋白聚糖的降解中，ADAMTS-4，-5是主要的降解酶。
　　本課題首次對OPG影響軟骨細胞生長和功能進行系統(tǒng)的研究，體外細胞實驗與

6、動物體內實驗相結合，在分子生物學，細胞學和病理組織學水平探索OPG對軟骨細胞的影響，并初步探討OPG抑制RA軟骨破壞的機制:1）體外驗證OPG對軟骨細胞的增殖能力的影響;2）探索OPG影響軟骨細胞的細胞內信號通路;3）探討OPG對軟骨細胞分泌細胞因子能力的影響;4）構建攜帶OPG基因的腺病毒，構建RA關節(jié)炎模型CIA;5）評價OPG基因治療CIA大鼠后的關節(jié)軟骨破壞;6)探討軟骨細胞凋亡在CIA軟骨破壞中的作用以及OPG基因治療對軟骨細

7、胞凋亡的影響;7）評價OPG基因治療后ADAMTS-5的分泌水平的改變。
　　第一部分骨保護素對體外軟骨細胞增殖及分泌功能的影響
　　目的:
　　體外研究骨保護素(osteoprotegerin，OPG)對軟骨細胞增殖能力和分泌功能的影響。
　　方法:
　　從1周齡SD大鼠的膝關節(jié)中，采用膠原酶消化法獲取原代軟骨細胞。甲苯胺藍染色鑒定軟骨細胞。本實驗應用第一代軟骨細胞。細胞計數(shù)試劑金(CellCountin

8、g Kit-8，CCK-8)檢測5，10,20，25，50，100，200 ng/ml濃度OPG對軟骨細胞增殖能力的影響。以MEK抑制劑U0126，ERK抑制劑PD098059，P38MAPK抑制劑SB203580預處理30分鐘，再加入OPG刺激，進行CCK-8試驗，用以探索OPG對軟骨細胞通路的影響。MAPK家族中的三條信號通路關鍵蛋白ERK，P38MAPK和JNK由蛋白質免疫印跡法(western-blotting)檢測刺激后磷酸化

9、水平。定量PCR和western-blotting測定OPG刺激后軟骨細胞分泌的細胞因子和組成成分表達量的變化。
　　結果:
　　OPG在5-50 ng/ml濃度能促進軟骨細胞增殖，最佳效應濃度為10 ng/ml。U0126，PD098095可以顯著抑制OPG誘導的軟骨細胞增殖。OPG刺激后15分鐘，軟骨細胞內MEK和ERK蛋白的磷酸化分別增強至0分鐘時的4.12倍和3.50倍，而P38MAPK和JNK的蛋白磷酸化則無明顯變

10、化。OPG顯著下調軟骨細胞ADAMTS-5分泌，上調TIMP-4的分泌，但對TIMP-1、2、3，IGF-Ⅰ，TGF-β，bFGF，BMP-2，ADAMTS-4，Collegan-Ⅱ，Aggrecan的表達無顯著影響。同樣， ERK蛋白抑制后，OPG誘導ADAMTS-5和TIMP-4的表達改變也被抵消。
　　結論:
　　OPG通過MEK/ERK信號通路促進軟骨細胞的增殖。同時，OPG能下調ADAMTS-5表達和上調TIMP-