肌腱干細胞和間質(zhì)細胞衍生因子復合蠶絲-膠原支架促進肌腱再生的研究.pdf

1、背景:
　　 隨著我國國民素質(zhì)的提高以及人們對健康體魄的向往,國人參加體育鍛煉和競賽活動的數(shù)量明顯增加,運動損傷也越來越多,其中韌帶肌腱損傷占50％以上。當前,自體移植、同種異體移植、異種移植和假體材料修復術(shù)經(jīng)常用于修復韌帶和肌腱損傷。然而,這些手術(shù)重建再生技術(shù)有不同的弊端,例如供體部位并發(fā)癥、疾病傳播、免疫排斥和較差的支架整合性。
　　 近10年,隨著組織工程的興起,臨床醫(yī)學正步入一個“再生醫(yī)學”的新階段。在組織的修復

2、過程中,種子細胞占據(jù)了很重要的成分。常用種子細胞包括肌腱韌帶中的成纖維細胞,皮膚來源的成纖維細胞,骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs),胚胎干細胞(ESCs)和誘導的多能干細胞(IPSs)等。這些細胞有自己的優(yōu)勢,同時也存在著一定的弊端,如細胞外基質(zhì)排列還顯紊亂,修復部位的骨化,一定的畸胎瘤發(fā)生率.最近,研究者們從肌腱組織中分離出了一種新型的干細胞,稱之為肌腱干／祖細胞(TSPCs)。這些細胞不僅有像MSC一樣的干細胞特性,而且高表達肌腱相關(guān)

3、的基因和蛋白質(zhì)。這些結(jié)果提示肌腱來源的肌腱干細胞(TSPCs)有修復損傷肌腱的潛能。除了外源性的種子細胞,機體內(nèi)部(內(nèi)源性)的細胞動員也是促進損傷組織修復的一個重要方面。
　　 在肌腱的生長、發(fā)育、損傷和修復過程中,有很多的生長因子和細胞因子參與了活動。如血小板相關(guān)生長因子BB(PDGF-BB)、胰島素樣生長因子(IGF-1)、表皮生長因子(EGF),轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)家族等。在我們之前的細胞治療研究中,我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長

4、因子-beta3(TGF-beta3),生長分化因子5(GDF5),骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP2),bFGF和間質(zhì)細胞衍生因子(SDF-1)等在損傷部位含量升高。Minami和他的同事們的一項最近研究闡明了SDF-1的局部表達增加可以促進BMSCs在系統(tǒng)注入后在損傷位點的遷移。我們認為局部釋放的SDF-1可以調(diào)節(jié)損傷韌帶和肌腱的修復。
　　 鑒于肌腱組織需要承受強大的力學,在損傷肌腱的組織工程中,我們需要通過支架材料復合干細胞或是

5、生長因子／細胞因子等手段來促進身體已損傷組織的再生。在我們之前的研究工作中,我們把蠶絲和膠原海綿復合在一起,構(gòu)建出了一個實用的肌腱組織工程支架。然而修復肌腱的結(jié)構(gòu)和功能與正常肌腱相比較,還是相差甚遠。一種理想的,能吸引目的細胞在損傷部位集聚的有生物活性的蠶絲支架的組合仍然面臨著巨大的挑戰(zhàn)。
　　 在此研究中,我們將蠶絲-膠原支架作為TSPCs和SDF-1體內(nèi)移植的載體,通過兩者的復合,來研究復合蠶絲-膠原支架能否進一步促進損傷肌

6、腱的修復。我們的研究將為損傷肌腱的修復帶來一種新的方式。
　　 我們的研究分為三部分:(1)種子細胞(TSPCs)的分離和鑒定(2)TSPCs復合蠶絲-膠原支架構(gòu)建組織工程肌腱,評估TSPCs對肌腱損傷修復的促進作用；(3)間質(zhì)細胞衍生因子(SDF-1)復合蠶絲-膠原支架構(gòu)建組織工程支架用于損傷肌腱的修復,評估SDF-1趨化的內(nèi)源性細胞對肌腱損傷修復的促進作用:
　　 第一章種子細胞(TSPCs)的分離和鑒定
　　

7、 目的:肌腱干細胞是近幾年發(fā)現(xiàn)的,來源于肌腱組織的干細胞。本部分的目的是研究肌腱干細胞的分離及三系分化能力的鑒定。
　　 方法與結(jié)果:體外試驗中,我們評估了肌腱干細胞的克隆形成能力和三系分化能力。結(jié)果顯示肌腱干細胞顯示了干細胞的一般特性,如克隆形成能力,增殖能力強和多系分化能力等。
　　 結(jié)論:來源于肌腱組織的肌腱干細胞(TSPCs)具有干細胞的一般特性,可能是體內(nèi)肌腱修復的理想外源性種子細胞來源。
　　 第二

8、章肌腱干細胞復合蠶絲.膠原支架促進肩袖韌帶修復
　　 目的:研究肌腱干細胞復合蠶絲.膠原支架能否促進肩袖韌帶的修復。
　　 方法與結(jié)果:體外試驗中,我們評估了肌腱干細胞在材料表明的生長,增殖,肌腱相關(guān)基因表達情況。在體內(nèi)試驗中,我們選擇兔子肩袖損傷作為動物模型,將肌腱干細胞種植于蠶絲-膠原支架上后移植入兔子體內(nèi)評估其修復效果。結(jié)果顯示肌腱干細胞顯示了干細胞的一般特性,如克隆形成能力,增殖能力強和多系分化能力等。體外種植的

9、肌腱干細胞在蠶絲-膠原支架上增殖良好,無細胞毒性。體內(nèi)細胞移植結(jié)果顯示移植的細胞-支架沒有引發(fā)免疫反應(yīng),相反,在術(shù)后4周和8周的時間點,其促進了更多成纖維樣細胞的長入,減少了炎癥細胞的浸潤。術(shù)后12周,肌腱干細胞處理的實驗組比單純支架的對照組表現(xiàn)為更多膠原組織的沉積,更好的膠原結(jié)構(gòu)和力學特性。
　　 結(jié)論:移植的肌腱干細胞通過分化為肌腱細胞和釋放抗炎癥因子抑制炎癥反應(yīng)等來促進損傷肩袖組織的修復。因此,肌腱干細胞復合的蠶絲-膠原支

10、架是具有一定的臨床應(yīng)用價值的肌腱組織工程支架。
　　 第三章外源性間質(zhì)細胞衍生因子-1(SDF-1)復合蠶絲-膠原支架協(xié)同增強損傷肌腱的再生
　　 目的:本研究目的是通過復合外源性的間質(zhì)細胞衍生因子來構(gòu)建一種具有生物活性的、能選擇性促進內(nèi)源性細胞遷移的蠶絲-膠原支架用于損傷肌腱的修復。
　　 方法與結(jié)果:在體外,我們評估了外源性間質(zhì)細胞衍生因子(SDF-1)對大鼠骨髓間充質(zhì)細胞(BMSCs)、皮下成纖維細胞(HD

11、Fs)和跟腱細胞(ATFs)的轉(zhuǎn)移和相關(guān)基因表達的影響,構(gòu)建的支架促進肌腱再生的效率在大鼠體內(nèi)跟骨腱(AT)損傷模型中測定。體外結(jié)果顯示BMSCs和HDFs的CXCR4基因表達和細胞遷移對外源性SDF-1敏感,而HDFs和ATFs的肌腱相關(guān)基因表達對外源性SDF-1更敏感。在大鼠AT損傷模型中,術(shù)后4天和1周外源性SDF-1在損傷部位可以減少炎癥細胞的浸入、加強成纖維狀的細胞轉(zhuǎn)移。4周后,SDF-1處理的實驗組較單純材料的對照組表現(xiàn)為內(nèi)