簡介：自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血，是當今人類致死、致殘的最常見腦血管疾病之一。顱內動脈瘤破裂出血，則是最常導致自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血的原因，前交通動脈瘤（ANEURYSMOFTHEANTERICOMMUNICATINGARTERY，AACA）約占到顱內動脈瘤發(fā)生率的30％。前交通動脈瘤的發(fā)生位置具有特殊性，在兩側大腦前動脈之間，而目前對于前交通動脈瘤的治療，還是以外科手術夾閉及介入栓塞治療為主。因此，前交通動脈瘤破裂后出血刺激及出血后的治療常常直接影響到患者大腦額葉的功能，進而影響到患者的認知功能。1993年首次提出的血管性認知障礙（VCI）的概念，即指由腦血管危險因素（如高血壓、糖尿病和高脂血癥）、明顯（如腦梗死和腦出血）或不明顯的腦血管?。ㄈ缒X白質疏松和慢性腦缺血）引起的從輕度VCI（MVCI）到癡呆的一類綜合征。而國內外大多數(shù)關于血管性認知障礙的研究的均集中在缺血性腦血管病方面。而由于近年關于血管性認知功能障礙逐漸成為研究熱點，也有越來越多的學者將研究對象轉向了出血性腦血管疾病，而由前交通動脈瘤治療后引起的認知功能障礙具有一定的代表性。目的研究探討前交通動脈瘤本身及手術夾閉與介入栓塞兩種治療方法對前交通動脈瘤患者認知功能的影響。方法①采用簡易精神狀態(tài)量表（MMSE）對206例前交通動脈瘤患者進行分析研究，其中開顱動脈瘤夾閉患者125例，介入栓塞患者81例，另取正常組40例作為對照組，對比患者組與對照組MMSE評分的差異。以及采取兩種治療方法后認知功能障礙發(fā)生率之間的差異。②根據(jù)患者接受MMSE評分距患者接受治療的時間間隔分為接受治療后六個月、一年、兩年、三年四組，分別對比四組患者認知功能障礙發(fā)生率之間的差異。③分析2011年的51例病例的術前、術后MMSE評分，了解前交通動脈瘤患者術前認知功能狀況，并對比分析兩組患者術前、術后認知功能變化。結果①所有的206例病例中，手術夾閉組患者認知功能障礙發(fā)生率為4960％，介入栓塞組為3457％，二者認知功能障礙發(fā)生率經(jīng)Χ2檢驗比較差異顯著（P②根據(jù)患者接受MMSE評分距患者接受治療的時間間隔分成的四組患者認知功能障礙發(fā)生率分別為6275％、4444％、2667％、3448％，經(jīng)Χ2檢驗分析后得出它們之間差異顯著（P③分析2011年的51例病例的術前、術后MMSE評分均值分別為2671±070，和2416±111，兩者經(jīng)配對樣本T檢驗后，兩者差異顯著（P結論①前交通動脈瘤患者經(jīng)兩種治療方法后均可能出現(xiàn)認知功能障礙，并且接受手術治療的患者認知功能障礙發(fā)生率高于接受介入栓塞治療。②隨著MMSE評分的時間距患者接受治療的時間的增加，患者表現(xiàn)出認知功能障礙的發(fā)生率在下降。③前交通動脈瘤患者術前既有認知功能障礙發(fā)生，兩種治療手段對術前即出現(xiàn)的認知功能障礙無改善作用，并且可能增加認知功能障礙的發(fā)生率及加重認知功能障礙的程度。而介入栓塞對患者的認知功能的影響相對手術夾閉較小。

簡介：該研究通過神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)應用腺病毒介導LACZ基因在神經(jīng)干細胞的轉染與表達成功地建立了以神經(jīng)干細胞為載體的基因治療方法在該實驗的研究過程中自胚胎1416D大鼠室管膜下區(qū)及海馬結構中運用無血清培養(yǎng)技術成功地培養(yǎng)出神經(jīng)干細胞并在EGF、BFGF等細胞因子的刺激下神經(jīng)干細胞能在體外進行增殖且均為NESTIN陽性細胞腺病毒能介導LACZ基因在神經(jīng)干細胞上表達這一研究為神經(jīng)干細胞介導的基因治療提供了堅實的基礎結論1、神經(jīng)干細胞原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)的成功為我們今后研究神經(jīng)干細胞的增殖、分化以及應用細胞移植治療神經(jīng)外科疾病提供了堅實的基礎2、腺病毒介導LACZ基因在體外的成功連接并在HEK293細胞上成功的組裝、分泌為我們應用基因技術治療神經(jīng)外科系統(tǒng)疾病的基礎與臨床研究提供了分子生物學基礎3、腺病毒介導的LACZ基因可轉入體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞并高效表達同時神經(jīng)干細胞的形態(tài)、生長特性和增殖能力并不受影響為神經(jīng)干細胞介導基因治療促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)的修復與再生奠定了基礎

簡介：第一部分大鼠頸部異位心臟移植模型的建立及術中常見問題的分析和處理目的建立大鼠頸部異位心臟移植模型，分析手術過程中常見的問題并處理，為快速掌握該技術提供理論基礎。方法以SD大鼠為供體，WISTAR大鼠為受體建立大鼠頸部異位心臟移植模型。觀察手術過程中各環(huán)節(jié)出現(xiàn)的問題并加以改進。結果常見的問題有動靜脈梗阻、出血，心臟不復跳，麻醉效果差等。經(jīng)過方法的改進可以減少和避免問題的出現(xiàn)。結論只要處理好常見的幾個問題，就可以很快的提高手術成功率。第二部分HTK液和UW液對大鼠原代心肌細胞冷保存的保護作用目的研究HTK液和UW液對體外培養(yǎng)的大鼠原代心肌細胞冷保存中的保護作用。方法體外培養(yǎng)大鼠原代心肌細胞，分別用生理鹽水，UW液和HTK液在0～4℃保存心肌細胞6H、8H、10H、12H。檢測保存液的AST和LDHL，臺盼藍染色法計算心肌細胞的生存率。結果UW液組和HTK液組的AST和LDHL均比生理鹽水組極顯著低下，心肌細胞的生存率則極顯著的高于生理鹽水組。而在12H，HTK液組的AST和LDHL顯著低于UW液組，心肌細胞的生存率在8H和10H也明顯高于UW液組。結論HTK液和UW液均對體外培養(yǎng)的大鼠原代心肌細胞的冷保存有明顯的保護作用。而HTK液相對于UW液更能延長對心肌細胞的冷保存時間。第三部分1，6二磷酸果糖和HTK液對大鼠原代心肌細胞冷保存的保護作用目的研究1，6二磷酸果糖和HTK液在體外培養(yǎng)的大鼠原代心肌細胞冷保存中的保護作用。方法體外培養(yǎng)大鼠原代心肌細胞，分別用生理鹽水A組、1，6二磷酸果糖B組、HTK液C組和1，6二磷酸果糖加HTK液的混合液D組在0～4℃保存心肌細胞6H、8H、10H。檢測保存液的ALT和LDHL，心肌細胞NAKATPASE活力，臺盼藍染色法計算心肌細胞的生存率。結果C組和D組的AST、LDHL均比A組和B組顯著低下P＜0001，細胞的NAKATPASE活力和生存率則顯著提高P＜0001。而在6H，D組的AST、LDHL顯著低于C組P＜001，心肌細胞的NAKATPASE活力和生存率明顯高于C組P＜001。結論HTK液和1，6二磷酸果糖加HTK液的混合液均對體外培養(yǎng)的大鼠原代心肌細胞的冷保存有明顯的保護作用。而混合液相對于HTK液在短期內對心肌細胞的冷保存有更好的效果。第四部分MIL4基因腺病毒載體的構建目的構建含MIL4基因的重組腺病毒載體，并在血管內皮細胞中進行蛋白表達鑒定。方法用限制性內切酶酶切DFGMIL4NEO質粒得到MIL4基因，將MIL4的CDNA插入到腺病毒穿梭質粒PADSHUTTLECMV，線性化后與腺病毒骨架載體PADEASY1電穿孔共轉染ECOLI菌株BJ5183，使之同源重組，產生腺病毒基因組質粒PADMIL4，然后經(jīng)PACⅠ酶切線性化，脂質體介導PADMIL4轉染293細胞，包裝出具有感染力的復制缺陷型的重組腺病毒載體ADMIL4。擴增后收獲病毒，氯化銫密度梯度離心純化，檢測病毒滴度。重組腺病毒感染小鼠血管內皮細胞，應用ELISA法檢測上清液中MIL4的水平，觀察MIL4蛋白表達情況。結果DNA測序分析表明克隆的MIL4基因與文獻報道一致，酶切鑒定證實MIL4基因正確地插入表達載體中。重組腺病毒純化后病毒滴度達到5109PFUML。應用ELISA法檢測上清液，MIL4的水平在血管內皮細胞中獲得高效表達。結論成功構建了含有MIL4基因的重組腺病毒載體，重組腺病毒能有效介導MIL4基因在血管內皮細胞中表達，為進一步研究其生物學功能奠定了基礎。第五部分腺病毒載體轉染MIL4基因對小鼠移植心臟的保護作用目的研究腺病毒載體轉染MIL4基因對小鼠移植心臟的保護作用，并探討其作用機制。方法首先構建含有MIL4基因的腺病毒載體，以小鼠頸部心臟移植模型基礎，將ADMIL4經(jīng)冠狀動脈注入供心后，在0～4℃的FDPHTK液的混合液中保存2H，植于小鼠頸部。術后分別在1D、2D、3D、5D用ELISA法測血清中MIL4的濃度，觀察移植心臟的存活期并行病理學分析。結果與空基因的腺病毒組相比較，實驗組的MIL4濃度明顯升高，移植心臟的中位生存期有所延長。病理學分析排斥明顯減輕。結論腺病毒載體轉染MIL4基因對小鼠移植心臟有保護作用。

簡介：目的回顧性分析124例病毒性腦炎患者的臨床資料，探討影響其預后的因素。方法對2001年1月至2006年12月我院神經(jīng)內科住院治療的124例病毒性腦炎患者的臨床表現(xiàn)及輔助檢查結果進行回顧性分析，對預后進行評估，采用SPSS115統(tǒng)計軟件進行分析，探討影響預后的因素。結果預后差的患者意識障礙持續(xù)時間明顯長于預后好的患者P0001；預后差的患者多伴有EEG重度異常P005且頭MR病變范圍廣P005。意識障礙持續(xù)時間P0001，31673、頭MR病變范圍P0028，10753及EEG異常程度P0034，21412與預后顯著相關。結論影響病毒性腦炎患者預后的因素為意識障礙持續(xù)時間、腦電圖異常程度、頭MR病變范圍。

簡介：目的樹突狀細胞DENDRITICCELLS，DC作為目前發(fā)現(xiàn)的抗原提呈能力最強的專職抗原提呈細胞，控制著免疫應答的性質、強度和免疫記憶性。隨著DC體外培養(yǎng)技術的建立，已有多項研究表明，體外培養(yǎng)的不成熟DC可高效攝取病毒樣顆粒VIRUSLIKEPARTICLES，VLPS，不僅可誘導體液免疫的發(fā)生，而且可通過交叉抗原提呈途徑，激發(fā)細胞免疫反應。在此過程中，VLPS除作為抗原表達載體為DC提供了特異性抗原外，還可刺激DC成熟，誘導DC的MHCI和II類分子及一些黏附分子的表達。因此，用VLPS負載DC，構建DC疫苗，為腫瘤和胞內感染病原疫苗的研制開辟了新的途徑。乙肝病毒核心抗原HEPATITISBCE，HBC是乙肝病毒的重要結構蛋白，在細菌、酵母菌及哺乳動物細胞內均能高效表達、自動裝配成球形顆粒，并可插入外源短肽，同時保持外源肽或表位正確構象，有較強免疫原性。因此，用HBCVLPS負載DC，可能是DC疫苗研究的較好模型。隨人類基因組計劃實施和推進，生命科學研究進入后基因組時代，新的學科蛋白質組學PROTEOMICS誕生。蛋白質組學可剛來研究細胞內所有蛋白質及其動態(tài)變化規(guī)律，能從更深一層次認識生命活動的規(guī)律?；谏鲜鲈?，在本研究中，我們在原核系統(tǒng)表達了乙肝核心蛋白，以其組裝成的乙肝核心蛋白病毒樣顆粒HBCVLPS為模型，首次采用能獲得高通量信息的蛋白質組學技術研究DC攝取HBCVLPS后細胞整體蛋白譜的改變，通過基質輔助激光解析電離飛行時間質譜MATRIXASSISTEDLASERDESPTIONIONIZATIONTIMEOFFLIGHTMASSSPECTROMETRY，MALDITOFMS鑒定得到了有意義的蛋白質，為研究DC細胞活化和DC疫苗的免疫機制提供了新的線索和思路。方法1乙肝核心蛋白病毒樣顆粒的制備擴增PET28AHBC的工程菌，IPTG誘導蛋白表達，包涵體形式表達的HBC蛋白的變性、NINTA親和層析純化和復性。2HBCVLPS的鑒定通過SDSPAGE電泳、蛋白免疫印跡實驗檢測HBC蛋白的表達和免疫原性，透射電鏡觀察HBC蛋白VLPS的形成。3小鼠骨髓源樹突狀細胞的體外培養(yǎng)樹突狀細胞由小鼠骨髓獲得經(jīng)細胞因子RMLL4和RMGMCSF誘導分化成為未成熟BMDC。4BMDC對HBCVLPS的吞噬激光共聚焦顯微鏡觀察不同時間點小鼠BMDC對HBCVLPS的吞噬。5流式細胞儀分析BMDC表面分子標記FITC標記的抗小鼠CD11C抗體SDFITC標記的抗小鼠CD86、CD80和MHCII分子抗體表面染色后，流式細胞儀檢測。6細胞因子的MRNA水平測定常規(guī)方法抽提不同處理組BMDC細胞的總RNA，將MRNA反轉錄為CDNA片段。用合成的細胞因子IFNΓ、TL12和內參照ΒACTIN的引物，擴增CDNA片段并進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。7BMDC攝取HBCVLPS前后細胞總體蛋白表達的差異及差異蛋白的質譜分析①攝取HBCVLPS前后BMDC細胞總蛋白的二維電泳I蛋白樣品的準備提取細胞蛋白經(jīng)CLEANUP處理后，BCA法測定蛋白樣品濃度。II二維電泳一向等電聚焦，每根IPG上樣150ΜG，經(jīng)30伏持續(xù)低電壓水化、200伏，1小時除鹽后，梯度升壓、穩(wěn)壓至8000伏，持續(xù)68小時，保證總量為50000伏特小時；二向聚丙烯酰胺凝膠電泳SDSPAGE灌制板膠、將膠條平衡處理后轉移至膠板、20MAGEL垂直電泳56小時。Ⅲ硝酸銀染色固定、敏化、漂洗、硝酸銀染色、漂洗、顯色、終止、漂洗、1％乙酸中保存。②蛋白點分析與選取凝膠通過CHEMIIANLGETM5500成像系統(tǒng)獲得數(shù)字化的圖像。使用計算機應用圖像軟件IAMGERMASTERTM50對圖像進行分析，選取明顯差異的蛋白點3倍或以上差異。③基質輔助激光解析離子化飛行時間質譜質譜鑒定選取蛋白并在UNIPROT和NCBINR數(shù)據(jù)庫中進行肽質量搜索，明確它們可能是何種蛋白。8根據(jù)質譜鑒定結果對膜聯(lián)蛋白A2蛋白的表達量的變化進行WESTENLBLOT實驗驗證。9體內殺傷實驗①免疫C57BL6小鼠將BMDC與HBCVLPS共孵育24小時，用LPS誘導細胞成熟，將HBCVLPSBMDC約3106皮下注射小鼠②7天后，取正常C57BL6小鼠脾細胞，HBC抗原肽刺激8小時后用5NM56羧基熒光素琥珀酰亞胺酯56CARBOXYFLUESCEINNSUCCINIYLESTER，CFSE標記。用05NMCFSE標記未經(jīng)抗原肽刺激的淋巴細胞，將高、低濃度標記的淋巴細胞按11比例混合后約34107，靜脈注射給前期免疫的小鼠，12小時后，取脾臟，流式細胞儀檢測，按下列公式計算CTL殺傷百分率CTL％1CFSEHIGHCFSELOW100。10數(shù)據(jù)統(tǒng)計所有數(shù)據(jù)均用STUDENTSTTEST進行統(tǒng)計分析。結果1原核表達系統(tǒng)PET28AHBC重組質粒的蛋白表達、NINTA親和層析純化成功得到HBC蛋白。WESTERNBLOT實驗證實了變復性后的蛋白能被抗HBC單抗所特異性地識別。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)HBC蛋白能正確自主組裝成蛋白顆粒，顆粒大小約22NM。2小鼠BMDC的成功培養(yǎng)光學顯微鏡觀察證實體外培養(yǎng)BMDC的有DC的典型形態(tài)特征流式細胞儀檢測BMDC表面標志分子CD11C陽性表達率超過75％。3激光共聚焦顯微鏡觀察到HBCVLPS能快速、大量被BMDC吞噬，表明體外培養(yǎng)的BMDC有較強吞噬能力。4HBCVLPS能誘導BMDC活化，提高其抗原提呈能力流式細胞儀檢測UNTREATEDBMDC組、HBCVLPSBMDC組、LPSBMDC組的表面標記分子CD86表達率分別為1720％、4245％、4651％，CD80的表達率分別為1617％、47485％、5658％，MHCII分子的表達率分別為40423％、63568％、7881％；RTPCR結果證實HBCVLPSBMDC組IL12和IFNΓ的MRNA水平明顯高于UNTREATEDBMDC組。5二維電泳檢測負載HBCVLPS前后BMDC細胞總蛋白譜的差異表達。通過IMAGEMASTERTM軟件對凝膠進行分析，每張凝膠上檢到500600個點，凝膠間匹配率大于70％。HBCVLPSBMDC組和DPBSBMDC組凝膠之間有8個蛋白點顯示3倍以上表達量差異。選取其中蛋白表達量較高的蛋白點6個，進行MALDITOF質譜鑒定，并在UNIPROT和NCBINR數(shù)據(jù)庫中進行肽質量搜索，得到4個己知蛋白ISOCITRATEDEHYDROGENASE3NADALPHA、ISOFMCRA_E、GROWTHFACTRECEPTBOUNDPROTEIN2、SIMILARTOEPIPLAKIN、ANNEXINA2。以內參ΒACTIN的表達量為參照，通過WESTERNBLOT驗證發(fā)現(xiàn)BMDC在攝取吞噬HBCVLPS后ANNEXINA2表達量減少。6體內殺靶的方法驗證HBCVLPS負載的BMDC誘導特異性CTL活性流式細胞儀檢測熒光標記的細胞數(shù)，直方圖顯示靶細胞的百分比M2。在未處理組、PBS處理組、HBCVLPS負載的BMDC組M2范圍分別為4649％、4751％、1719％。M2與被殺傷靶細胞的數(shù)量成反比，表明HBCVLPS負載BMDC組可誘導高水平特異性CTL活性。結論1從大腸桿菌的包涵體成功獲得了高純度的HBCVLPS。2形態(tài)學觀察和細胞標志分子的檢測表明在體外成功培養(yǎng)出小鼠骨髓源樹突狀細胞。3激光共聚焦顯微鏡和流式細胞儀觀察證實，小鼠BMDC可在體外有效攝取HBCVLPS；攝取后BMDC進一步成熟與活化細胞表面標志分子CD86、CD80、MHCII表達增加，抗原提呈能力增強。4體內殺傷實驗顯示用HBCVLPS負載的BMDC免疫小鼠，可誘導產生抗原特異性T細胞應答，CTL活性增強。5二維電泳實驗發(fā)現(xiàn)HBCVLPSBMDC組和UNTREATEDBMDC組的蛋白譜存在若干表達差異的蛋白點。6蛋白質譜分析出肽段，再從數(shù)據(jù)庫進行肽質量搜索，得到4個己知蛋白ISOCITRATEDEHYDROGENASE3NADALPHA，ISOFMCRA_E、SIMILARTOEPIPLAKIN、GROWTHFACTRECEPTBOUNDPROTEIN2、ANNEXINA2。后2個蛋白在細胞的分化、增值、凋亡等過程中有重要的作用。7蛋白免疫印跡實驗證實與PBSBMDC組相比，HBCVLPSBMDC組中蛋白膜聯(lián)蛋白A2ANNEXINA2的表達量減少，提示DC活化的抑制因素減少，而表現(xiàn)出增強DC生命力的作用，從而增強激活T細胞的能力。

簡介：分類號密級單位代碼10114學號20060003呂梁地區(qū)農村阿爾茨海默病及輕度認知障礙與同型半胱氨酸的關系研究生孫煌嬗指導教師生41嬡麴援申請學位門類級別醫(yī)堂亟童些堂魚≥專業(yè)名稱疊經(jīng)痘堂研究方向匭筮夔篷魃痘所在學院出酉醫(yī)型太堂箍二隆廢醫(yī)堂暄二。一三年五月十四日目錄主要英文縮略語索引I中文摘要II英文摘要Ⅳ正文1前言1日LJ舌L對象和方法。。。。4結果8討論10結論。14參考文獻15綜述19正文19參考文獻25附錄30致謝33個人簡介34

簡介：Y1406856中山大學博士學位論文腺病毒載體介導的可溶性VEGF受體FLT1SFLT1抑制多發(fā)性硬化單核／巨噬細胞浸潤的實驗研究ADENOVIRUSMEDIATEDSOLUBLEVEGFRECEPTORFLTISFIT11GENEDELIVERYINHIBITSMONOCYTELINEAGECELLSRECRUITMENTINEXPERIMENTALAUTOIMMUNEENCEPHALOMYELITIS博士研究生朱燦勝學科、專業(yè)神經(jīng)病學導師胡學強教授答辯委員會主席答辯委員會委員中山大學附屬第三醫(yī)院廣州二OO七年六月二日中山大學博士學位論文競爭結合VEGF，并且能與膜表面受體FIT．1及KDR形成同源或異源二聚體，中止活化信號的傳遞，從而阻斷VEGF的生物學活性，因此SFLT．1可能是VEGF體內天然抑制劑。目前國外已有利用SFLT．1進行抑瘤研究的報道，且收效較為顯著。VEGF對單核細胞具有趨化作用，誘導其遷移。單核／巨噬細胞表達FIT．1，在受到巨噬細胞抗原刺激后表達上調。VEGF的趨化作用認為是通過這一受體實現(xiàn)的。因此，利用VEGF體內天然抑制劑SFLT．1可以在體內封閉MSCNS內升高的VEGF，抑制其對炎癥細胞尤其是巨噬細胞的趨化作用，從而達到治療的目的。研究方法1通過PCR方法擴增SFLT．113基因，然后應用腺病毒包裝系統(tǒng)構建攜帶人SFLT．1／FLAG融合基因的重組腺病毒載體AD．SFLT．1／FLAG。應用ELISA、免疫組織化學、免疫熒光化學和WESTERN．BLOT法檢測所構建的重組腺病毒載體在真核細胞中的表達。通過TRANSWELL巨噬細胞趨化實驗和MATRIGELPLUG分析，進一步證實重組腺病毒所表達目的的生物學功能；2選取DA大鼠作為實驗動物，應用豚鼠脊髓加完全福氏佐劑制成勻漿誘導EAE模型；3應用FERIDEXMRI檢查監(jiān)測EAECNS內單核／巨噬細胞的浸潤情況；4通過側腦室注射AD．SFLT．1／FLAG阻止EAECNS內單核／巨噬細胞浸潤，并通過發(fā)病情況、病理改變、免疫組織化學、免疫熒光化學觀察，評價治療效果結果成功構建了AD．SFLT一1／FLAG，PCR檢測證實無野生型腺病毒及腺相關病毒的污染，ELISA、免疫組織化學、免疫熒光化學和WESTERN．BLOT法檢測顯示所構建的腺病毒載體攜帶的基因能夠在真核細胞中得到表達。TRANSWELL巨噬細胞趨化實驗和MMRIGELPLUG分析顯示VEGF對巨噬細胞具有趨化作用，而SFLT．1蛋白具有抑制VEGF對巨噬細胞趨化作用。選擇DA大鼠可成功誘導EAE模型，通過常規(guī)MRI檢查可發(fā)現(xiàn)EAE動物模型腦部病灶，F(xiàn)ERIDEX增強MⅪ檢查可以監(jiān)測EAECNS巨噬細胞浸潤情況。AD．SFLT．1／FLAG側腦室注射組動物發(fā)病率為50％，臨床評分為2．0士1．OO，與側腦室注射PBS發(fā)病率100％，臨床評分3．4士1．07和AD．EGFP發(fā)病率87．5％，臨床評分3．3士0．97組相比，差異具有顯著性。免疫組化及免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)EAECNS組織，尤其是脊髓，有大量的VEGF表達細胞，主要為星形膠質細胞，同時有伴有巨噬細胞浸潤。AD．SFLT．1／FLAG側腦室注射可以抑制EAECNS內單核／巨噬細胞的浸潤，從而降低EAE的發(fā)病率和改善EAE病情。結論本研究成功構建了人SFLT．1基因重組腺病毒ADSFLT．1／FLAG，并融合FLAG標簽；VEGF對巨噬細胞具有趨化作用；可溶性血管內皮生長因子受體FLT．1SFLT．1具有抑制VEGF對巨噬細胞趨化的作用；FERIDEX增強M對檢查可以監(jiān)測

簡介：第一部分冠脈內注射病毒轉染的肝細胞生長因子對冠心病患者外周造血干細胞的動員作用。目的探討經(jīng)冠脈內注射腺病毒ADENOVIRUS，AD轉染人肝細胞生長因了HEPATOCYTEGROWTHFACTHGF對嚴重冠狀動脈狹窄的患者外周造血干細胞的動員作用。方法本研究入選18例冠心病患者分為兩組給藥組經(jīng)冠脈注入ADSHGF9例和對照組經(jīng)冠脈注入等量生理鹽水9例。所有患者均于冠脈造影OH即術前、術后6H、24H、6D抽取外周血并應用流式細胞儀單克隆熒光抗體標記法檢測其外周造血干細胞表面抗原CD34、CD38及CD117。結果經(jīng)冠脈內給藥組術后6小時的CD34明顯高于對照組0104±0082VS0022±0012，P0021，OH、24H及6D的CD34兩組之間差異無統(tǒng)計學意義；經(jīng)冠脈內給藥組術后6天的CD117明顯高于對照組0058±058VS00120009，P0034，差異有統(tǒng)計學意義，其余時間點兩組間差異無統(tǒng)計學意義；CD38在各時間點差異均無統(tǒng)計學意義。結論經(jīng)冠脈內注射轉染腺病毒攜帶人HGF可能在短時間引起外周造血干細胞的動員。動員外周造血干細胞可能是HGF參與血管新生和器官組織損傷修復及抗調亡改善心功能的一個重要機制。第二部分冠脈內注射與心肌內注射腺病毒轉染的肝細胞生長因子對冠心病患者外周造血干細胞的動員作用。目的為了研究對嚴重病變的冠心病患者經(jīng)心肌內注射及經(jīng)非梗死相關冠脈注入轉染腺病毒ADENOVIRUS，AD攜帶人肝細胞生長因子HEPATOCYTEGROWTHFACTHGF對外周血CD34、CD117的動員作用，并比較其差異。方法本研究入選12例冠心病患者分為兩組經(jīng)心肌內注射組6例和經(jīng)相關的冠脈注入組6例。所有患者均行冠狀動脈造影術，并于OH即術前、術后6H、24H及6D抽取外周血并應用流式細胞儀單克隆熒光抗體標記法檢測其造血干細胞表面抗原CD34、CDLL7。結果1流式細胞儀單克隆熒光抗體標記顯示CD3424H時的經(jīng)非梗死的冠脈內給藥組明顯高于心肌內注射組P0042，在給藥后24H內呈增加的趨勢，但無統(tǒng)計學意義；CD117與術后6H及24H時經(jīng)非梗死的冠脈內給藥組明顯高于心肌內注射組P0018P0030有顯著的統(tǒng)計學差異，在兩組給藥后呈增加的趨勢，無統(tǒng)計學意義。結論經(jīng)冠脈內注射轉染腺病毒攜帶人HGF比心肌內注射能明顯的動員外周造血干細胞。動員外周造血干細胞可能是HGF參與血管新生、平滑肌的遷移和器官組織損傷修復等的一個重要機制。

簡介：知覺是人腦對于客觀事物綜合的，整體的反應。知覺的形成源于感覺通道自下而上地對事物個別屬性的信息編碼與傳遞，也依賴于主體的知識與經(jīng)驗的自上而下的指導。這給視知覺形成過程提供一個概念構架。神經(jīng)生理學對于視神經(jīng)系統(tǒng)的研究為視知覺形成過程提供了物質構架。但是對于視知覺信息加工過程本身，尤其是視覺初級加工和高級加工的相互關系，以及注意在視知覺中的作用缺乏綜合的，定量的實驗研究。本研究在圖形任務中結合對不同加工階段起作用的因素，如對初級加工階段影響較大的明度與視角因素，對知覺加工影響較大的立體朝向，實點位置；不同的視知覺任務，如整體任務和局部任務，絕對判斷和相對比較；以及綜合行為指標和眼動指標，力求對視知覺的加工層次有更清晰的定量描述。得到結果如下1視知覺存在初級加工和高級加工階段，各階段間有獨立性，也有聯(lián)動性。2知覺層次的加工更多影響注視次數(shù)，初級加工更多影響注視時間。3注意資源分配影響注視時間，一般注意資源分配越多，注視時間越長。但在“材料限制”下，作用可能相反。4男女在視知覺方式上有差異。比起女生，男生對知覺層次的信息量更加敏感，且更易形成整體知覺。而女生比男生更加善于觀察和辨認細小特征。5認知任務的明確存在與否，影響人的觀察方式。在消極觀察下，被試更傾向于保持一定的喚醒水平，對易于判斷的圖形更多注視。而有認知任務時，被試對較難判斷的圖形注視較多。6視覺對于刺激的變化敏感。任務為絕對判斷時，目標特征的變化需要較少注意資源；無關干擾使所需注意資源變大，目標變化與無關干擾的作用相互獨立。任務為相對比較時，目標與干擾的作用為交互，在有干擾時，目標特征的變化使所需注意資源不降反升。7對整體的知覺是不隨意，自動發(fā)生的；對局部細節(jié)特征的辨識不是自動發(fā)生的。整體知覺影響對細節(jié)特征的辨識，但沒有相反的作用。8固定的眼動頻率會被存儲，在自主觀察時會以相同注視時間發(fā)生眼動。

簡介：點擊查看更多人巨細胞病毒感染致小鼠腦組織同源盒基因表達改變的研究.pdf精彩內容。

簡介：南華大學碩士學位論文PIG11基因逆轉錄病毒載體的構建及其高表達對HEPG2細胞凋亡的影響姓名吳艷申請學位級別碩士專業(yè)病理學與病理生理學指導教師梁曉秋200705014PIG11基因逆轉錄病毒載體的構建及其高表達對HEPG2細胞凋亡的影響碩士研究生吳艷導師梁曉秋教授中文摘要目的構建人PIG11逆轉錄病毒載體，建立高表達PIG11基因的HEPG2細胞株，為進一步研究PIG11基因在肝癌細胞中的功能及促凋亡作用提供一個理想的試驗平臺。觀察PIG11基因高表達對HEPG2細胞凋亡的影響。方法將已有的PCDNA31/NTGFPPIG11質粒用PCR法擴增出PIG11片段，經(jīng)過酶切、T4DNA聚合酶連接等步驟將該片段重組入PLXSN逆轉錄病毒載體中，構建含人PIG11CDNA的重組質粒PLXSNPIG11。重組載體經(jīng)PCR鑒定和DNA測序分析。將該重組質粒用LIPOFECTAMINETM2000轉染包裝細胞PA317，獲得PLXSNPIG11逆轉錄病毒液。用病毒液感染NIH3T3細胞，檢測病毒滴度。再用病毒液感染HEPG2細胞，G418篩選，獲得PIG11高表達的HEPG2細胞株。應用RTPCR和WESTERNBLOT檢測經(jīng)感染后HEPG2細胞的PIG11表達。對成功感染PIG11基因的HEPG2細胞應用HE染色、DNALADDER以及流式細胞儀檢測等方法測定PIG11在HEPG2中高表達時對該細胞凋亡的影響。結果成功構建了PLXSNPIG11逆轉錄病毒載體，測序證明PIG11CDNA編碼序列與GENBANK中報道的一致。轉染PA317細胞后病毒釋放，經(jīng)檢驗病毒滴度為1105CFU/ML。用含病毒上清液感染HEPG2細胞，經(jīng)RTPCR和WESTERNBLOT檢測證實HEPG2細胞中PIG11MRNA及PIG11蛋白表達明顯升高。高表達PIG11的HEPG2細胞從形態(tài)學上可觀察到凋亡細胞增多，有明顯的DNALADDER條帶。流式細胞儀檢測顯示感染PIG11的HEPG2細胞凋亡率為4113±229，明顯高于未處理組細胞的凋亡率333±081和感染空載體細胞的凋亡率353±

簡介：Y784003中圖分類號R512．6．2瀘糾匿學陀研究生碩士學位論文PSIHBWX抵制乙肝病毒復制和表達的研究PTZU6I經(jīng)限制性內切酶SALI和XBAI酶切后，暴露SALI和XBA，酶切位點，直接與純化好的雙鏈DNA定向粘端連接，即構建好轉錄針對X基因轉錄體的發(fā)夾狀SIRNA轉錄載體PSIHBV／X。根據(jù)核酸分析軟件DNASSIST2．0的分析，重組體PSIHBV／X如下特點1．SALI酶切位點消失，故不能被該內切酶消化，仍為環(huán)狀質粒；2．XBAI位點存在，可被其切成約3．2KB大小的線狀DNA鏈；3．可被HIN卿＆以，切為2800BP和395BP的兩個片斷。酶切后1％瓊脂糖凝膠電泳結果顯示重組體符合如上特點，然后再將重組體提交給生物公司測序鑒定，結果證實重組體中含有克隆的目的片斷。至此，能在細胞內轉錄針對HBVX基因轉錄體的發(fā)夾狀SIRNA轉錄載體PSIH3V／X構建成功。通過脂質體介導法將PHBVL．3與PSIHBV／X按L1、120的比例共轉染肝癌細胞株HEPG2，同時設立感染對照組只轉染相同劑量的PHBVL．3，不加任何SIRNA和無關對照組PHBVL．3與無關SIRRA轉錄載體PSIGFP共轉染。轉染后分別于24H、48H、72H收集細胞上清液，使用ELISA法半定量HBEAG和HBSAG的含量，酶標儀讀出吸光度數(shù)值，結果用實驗孔吸光度A值／X寸照孔A值S肘值，S表示待測樣品，N表示陰性對照表示，IMEAGS／N值≥1．0、IMSAGS／N值≥2．0為陽性，計算PSIHBV／X對上述兩種抗原的抑制率。使用熒光定量PCR法觀察72H時HBVDNA含量的變化，由計算機軟件自動分析計算出定量結果，采用計算機對數(shù)平均值的方法計算HBVDNA平均拷貝數(shù)；實驗數(shù)據(jù)以夏±S表示，由SPSS10．0統(tǒng)計軟件進行處理，多組間單因素方差分析得出P值。分析上述結果，觀察PSIHBV／X對HBV的復制和抗原表達的抑制效

簡介：丙型肝炎病毒HCV感染所引起的丙型肝炎呈全球分布。據(jù)WHO估計，目前全世界約有18億HCV感染者，且呈增長趨勢。HCV是單股正鏈RNA病毒，HCV感染所致的丙型肝炎慢性化率高達75％～85％，可導致肝臟慢性炎癥壞死和纖維化，部分患者可發(fā)展為肝硬化甚至肝細胞癌，對人類的健康和生命構成了嚴重威脅。丙型肝炎病毒屬黃病毒屬，全長約96KB，為一單股正鏈RNA，分為5’非翻譯區(qū)UTR、一個開放讀碼框F和3’非翻譯區(qū)，編碼一個由3000多個氨基酸組成的復合蛋白前體，在宿主信號肽酶和病毒蛋白酶的作用下裂解產生至少10種基因產物四種結構蛋白CE，E1，E2，P7和六種非結構蛋白NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A，NS5B。而在HCV編碼的十幾種蛋白中，核心蛋白CE是HCV多聚蛋白前體經(jīng)細胞信號肽酶剪切而產生的非糖基化蛋白，由191個氨基酸組成。該蛋白的氨基酸序列十分保守，具有調控多種細胞基因，影響細胞生長、增生及凋亡的能力。近年來外國學者在感染HCV的患者血清中發(fā)現(xiàn)了HCVF蛋白，是由HCV核心基因編碼的另一個產物，它是由核心基因密碼子核苷酸移位后產生的。其在HCV不同基因型的高度保守性和在患者體內抗體的存在，顯示F蛋白在HCV生命周期中起重要作用。為了研究此種蛋白抗體在我國丙肝人群是否同樣存在及其分布情況，探討F抗體與HCV感染之間的關系。本文進行了如下研究第一部分丙型肝炎病毒F蛋白重組基因片段的克隆及其在細菌中的表達根據(jù)GENBANK提供的HCV1B序列設計引物，擴增F蛋白基因片段。PCR產物經(jīng)過純化后，與用BAMHⅠ和ECⅠ雙酶切，電泳回收后與用上述雙酶切割并電泳回收的PGEX4T2質粒連接，獲得的重組質粒轉化大腸桿菌TG1感受態(tài)細胞。PCR鑒定可擴增出與目的片段大小一致的DNA片段。同時提取重組質粒進行DNA序列測定與比對分析，結果證實DNA插入序列正確。對構建的重組工程菌用IPTG進行誘導表達，SDSPAGE電泳分析顯示HCVFGSTGLUTATHIONESTRANSFERASE特異性表達產物的分子量約為43KD，表達量占菌體蛋白的15％左右。本研究成功構建了表達丙型肝炎F蛋白重組基因片段的工程菌，為獲得抗原性強、特異性好的F蛋白抗原奠定了基礎。第二部分丙型肝炎病毒重組F表達蛋白的純化與初步鑒定將HCVFGST重組工程菌大量培養(yǎng)后加IPTG誘導表達，離心收菌并超聲破碎后進行SDSPAGE電泳檢測，證實表達蛋白為可溶性蛋白。將超聲裂解上清置入GLUTATHIONESEPHAROSE4B親和層析柱中，用洗脫液還原型谷胱甘肽洗脫。收集洗脫下來的蛋白溶液，進行SDSPAGE鑒定，并用紫外分光光度計測定蛋白濃度，于30℃保存?zhèn)溆?。同時轉化空質粒PGEX4T2入大腸桿菌，誘導表達GST蛋白，并進行GLUTATHIONESEPLAAROSE4B親和層析柱純化。將純化獲得的HCVFGST融合表達蛋白作抗原，稀釋后包被酶聯(lián)反應板，ELISA間接法檢測已知的4份抗HCV陽性血清、4份正常人血清。結果顯示此表達蛋白能與3份抗HCV陽性血清反應，而與1份抗HCV陽性血清和正常人血清不發(fā)生反應。同時WESTERNBLOT分析也證實此蛋白抗原能與陽性血清抗體發(fā)生特異性結合。以上結果初步說明該融合表達蛋白制備、純化較容易，并與丙肝病人血清出現(xiàn)特異性反應。本研究建立了表達蛋白的純化方法，并純化獲得了具有良好抗原性的HCVFGST蛋白抗原。第三部分用HCVFGST蛋白做為抗原檢測丙肝病人血清抗體將純化后的重組表達蛋白HCVFGST作為抗原包被酶聯(lián)反應板，以待測血清標本為一抗，辣根過氧化物酶標記的抗人IGG抗體為二抗，以GST蛋白孔作為本底對照，ELISA間接法分別檢測120份抗HCV陽性血清、10份正常人血清。結果重組蛋白與82份的抗HCV陽性血清均可發(fā)生特異性反應抗體陽性率68％，而與10份正常人血清不起反應。病例組與對照組有統(tǒng)計學差異P001。發(fā)現(xiàn)50歲以上年齡組抗HCVF抗體的陽性率高于20～50歲年齡組，有統(tǒng)計學差異P001；中重度和肝硬化患者陽性率最高P005；抗HCVF抗體在男性和女性患者中的檢出無統(tǒng)計學差異；且與患者血清中HCVRNA的檢出無統(tǒng)計學差異P0099，而在HCVRNA各型別之間的檢出亦無統(tǒng)計學差異P0926。以上結果表明該融合表達蛋白具有較好的抗原性和特異性。本研究建立了以ELISA間接法為基礎的HCVFGST抗體檢測方法，并對檢測試劑、反應條件進行了優(yōu)化。第四部分HCVFGST多克隆抗體的制備將純化后的重組表達蛋白HCVFGST作為抗原免疫BALBC小鼠，取鼠尾血用間接ELISA法檢測抗HCVF抗體效價≥110000。加強免疫后摘眼球取血，分離血清。WESTERNBLOT分析證實此免疫后血清可與HCVFGST蛋白發(fā)生特異性結合，正常小鼠血清不與此蛋白發(fā)生反應。結果表明該免疫血清與HCVFGST有良好的免疫反應性，為進一步研究HCVF蛋白在HCV感染和病程中的作用提供了實驗基礎。

簡介：本研究系統(tǒng)地應用狗腎細胞MDCK細胞模型和小鼠模型對中藥復方銀芩膠囊和芩連膠囊及重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子RHUGMCSF進行了體內、外的抗流感病毒作用的實驗研究。體外實驗以MDCK細胞為模型，采用MTT法檢測藥物對細胞存活率的影響，即藥物毒性濃度測定；以藥物對流感病毒導致的細胞病變CYTOPATHICEFFECT，CPE的抑制率為指標，確定藥物體外抗流感病毒有效濃度。結果顯示，銀芩膠囊和芩連膠囊在體外均可有效抑制流感病毒相關CPE的形成。銀芩膠囊的最大無毒濃度TCO為125MGML，50﹪毒性濃度TCSO為89MGML，對流感病毒50﹪有效抑制濃度ICSO為04MG／ML，治療指數(shù)TI達225。芩連膠囊的TCO為125ΜGML，TCSO為2818ΜMGML，ICSO為670ΜMGML，TL值為42?？紤]到RHUGMCSF是通過受體細胞發(fā)揮牛物學活性，因此采用從人抗凝靜脈血中分離的外周血單個核細胞PBMC為受體細胞，將PBMC在體外與RHUGMCSF共培養(yǎng)3天后，收集細胞上清液進行抗流感病毒體外實驗結果顯示，PBMC與80ΜMGML及以上濃度的RHUGMCSF共培養(yǎng)后，其細胞上清對CPE的抑制率可超過50﹪。RHUGMCSF的TCO為200ΜMGML，TCSO為3090ΜG／ML，ICSO為644ΜG／ML，TL值為48。體內實驗以昆明種小鼠為動物模型，小鼠感染病毒后2小時開始給藥，銀芩膠囊和芩連膠囊都采用口服給藥銀芩膠囊每日2次，芩連膠囊每日1次，共連續(xù)給藥六天，從感染之日起連續(xù)觀察14天。RHUGMCSF采用預防性治療給藥的方式，在小鼠感染病毒前先滴鼻給藥7天，每日1次，接種病毒后再滴鼻給藥3天，從感染之日起連續(xù)觀察14天。通過流感病毒感染小鼠的死亡率、牛命延長情況及肺病變程度指標判定其抗流感病毒作用。結果表明，試驗藥物均能減少流感病毒感染小鼠的死亡率，延長存活時間，減輕小鼠肺組織病變程度?？诜?0、03和01GKGD銀芩膠囊，對流感病毒感染小鼠的死亡保護率分別為40﹪、20﹪和5﹪，牛命延長率分別為661﹪、327﹪和248﹪，減輕小鼠肺病變分別為769﹪、539﹪和385﹪?？诜?、2、L、05和O25G／KGD芩連膠囊，對流感病毒感染小鼠的死亡保護率分別為40﹪、30﹪、30﹪、20﹪和O﹪，牛命延長率分別為832﹪、701﹪、645﹪、402﹪和75﹪，口服芩連膠囊4、1和05G／KG／D，減輕小鼠肺病變分別為514﹪、258﹪和82﹪。鼻腔途徑給予134、067和034MG／KGD的RHUGMCSF，對流感病毒感染小鼠的死亡保護率分別為80﹪、55﹪和50﹪，牛命延長率分別為1158﹪、746﹪和658﹪，減輕小鼠肺病變分別為400﹪、348﹪和48﹪。以上實驗數(shù)據(jù)表明，銀芩膠囊和芩連膠囊具有直接抑制流感病毒在宿主細胞內復制的作用，并且對模型小鼠的病毒性肺炎療效顯著，能有效降低感染小鼠的死亡率，延長存活時問和減輕小鼠肺組織病變程度。RHUGMCSF經(jīng)受體細胞介導后可產?？沽鞲胁《净钚?，采用經(jīng)鼻途徑預防性給藥治療方式亦可對模型小鼠產牛顯著的保護作用。這些實驗結果為銀芩膠囊和芩連膠囊的治療功效提供了抗流感病毒的實驗依據(jù)，為其開展臨床試驗提供了有力的支持，并且首次表明了免疫調節(jié)劑RHUGMCSF具有抗流感病毒的作用，本研究取得的結果也為建立抗流感病毒藥物療效和機制研究的平臺奠定了重要的工作基礎。

簡介：浙江大學碩士學位論文SARS冠狀病毒的基因組變異與進化研究姓名商磊申請學位級別碩士專業(yè)微生物學指導教師馮明光于軍20050501SARS冠狀病毒基因組的變異和進化研究摘要2003年3月，一種新的冠狀病毒COVSARS冠狀病毒被確認為引起SARSSCVEREACUTERESPIRATORYSYNDROME的病原。在本研究中，我們獲取了LO株直接來源SARS病人糞便或咽拭予樣本及其細胞傳代培養(yǎng)物的SARSCOV全基因組序列，并會同公共數(shù)據(jù)庫中的115株SARSCOV基因組序列進行了系統(tǒng)地比較分析。以GZ02序列為參照，發(fā)現(xiàn)266個在2個以上基因組中同時存在的單核營酸多態(tài)SNP位點。這些多態(tài)位點在SARSCOV基因組中呈偏態(tài)分布。同時發(fā)現(xiàn)了18種主要的缺失類型和2種主要的插入類型，定義了2種與發(fā)病時期及致死率相關的基因型。S蛋白在發(fā)病早期受到最大的正向選擇壓力，然后逐步穩(wěn)定下來。我們應用鄰位連接法NCIGHBORJOINING構建了125株SARSCOV的親緣樹。通過來源于同一病人的直接取樣樣本及其細胞傳代培養(yǎng)物的SARSCOV基因組序列對比分析發(fā)現(xiàn)，在細胞培養(yǎng)過程中SARSCOV基因組序列幾乎不會產生突變，但取樣時間策略將會影響這一過程。推測這種現(xiàn)象有可能是由于細胞傳代培養(yǎng)過程會選擇出某種優(yōu)勢株病毒造成的。關鍵司SARS冠狀病毒基因組；單核苷酸多態(tài)性；插入缺失；正向選擇壓力