簡介：目的由于HIV1本身具有快速復(fù)制及高突變率的特點(diǎn)在宿主的選擇壓力及藥物的選擇壓力下HIV感染者體內(nèi)存在高度復(fù)雜多樣且動(dòng)態(tài)變化的病毒準(zhǔn)種。目前常用的病毒分離方法均為共培養(yǎng)法此法分離得到的僅為個(gè)體內(nèi)準(zhǔn)種中一株或幾株優(yōu)勢毒株一些相對弱勢株會(huì)丟失不能得到完整的多樣的病毒描繪。目前國外學(xué)者已經(jīng)建立了通過有限稀釋共培養(yǎng)獲得生物性克隆HIV1毒株的方法。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用有限稀釋共培養(yǎng)方法從我國艾滋病感染者體內(nèi)分離單克隆的HIV1毒株旨在豐富及發(fā)展我國HIV的病毒分離方法并通過分析生物克隆病毒感染、復(fù)制能力以及基因序列的變異驗(yàn)證分離方法的正確性與可行性。迄今被美國FDA批準(zhǔn)的抗艾滋病藥物有27種只有5種藥物用于我國艾滋病患者免費(fèi)抗病毒治療耐藥毒株的出現(xiàn)和藥物的毒副作用導(dǎo)致艾滋病患者抗病毒治療失敗因此尋找高效、低毒的抗HIV1的藥物是當(dāng)前HIV治療中面臨的機(jī)遇與挑戰(zhàn)我國具有豐富的植物資源中草藥在抗HIV中的應(yīng)用已有廣泛報(bào)道。通過研究藏藥蕨麻提取物的抗HIV1活性以及其對相應(yīng)細(xì)胞的毒性作用為開發(fā)我國自主產(chǎn)權(quán)的抗艾滋病藥物提供可能。方法從新疆及北京HIV1感染者中選擇治療人群和未治療人群作為樣本通過有限梯度稀釋感染者外周血單個(gè)核細(xì)胞PERIPHERALBLOODMONONUCLEARCELLSPBMCS后進(jìn)行共培養(yǎng)的方法根據(jù)分離陽性率來選擇性地分離生物性克隆的HIV1毒株利用P24抗原檢測試劑盒定性的檢測病毒分離情況同時(shí)定期定量檢測病毒P24抗原的釋放分析各生物性克隆的HIV毒株間感染及復(fù)制能力的差異同時(shí)擴(kuò)增培養(yǎng)上清中HIV1V1V5區(qū)基因并測序分析比較各生物性克隆的HIV毒株間氨基酸序列的差異及聯(lián)系從而驗(yàn)證生物性克隆分離方法的可行性。藏藥蕨麻提取物由本科室提取分別用TZMB1、MT4和PBMCS檢測提取物的毒性作用對于TZMB1和MT4細(xì)胞系分別采用CCK8試劑及快速細(xì)胞分析儀CASYTT檢測各濃度下細(xì)胞的存活數(shù)量對于PBMCS僅選用CCK8法檢測并運(yùn)用REEDMUENCH法計(jì)算蕨麻提取物對于以上細(xì)胞的50％細(xì)胞毒性劑量50％CYTOTOXICITYCONCENTRATIONS，CC50。抗HIV1活性實(shí)驗(yàn)分別在TZMB1、MT4細(xì)胞系和PBMCS進(jìn)行蕨麻提取物對HIV1實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)株SF33的抑制實(shí)驗(yàn)用100TCID5050％TISSUECULTUREINFECTIVEDOSE50％組織細(xì)胞感染劑量感染細(xì)胞同時(shí)蕨麻提取物以402010525125ΜGML濃度加入細(xì)胞分別在感染3天或7天后利用熒光和HIVP24檢測試劑盒檢測病毒進(jìn)入細(xì)胞并復(fù)制狀況并運(yùn)用REEDMUENCH法計(jì)算蕨麻提取物對SF33的半數(shù)抑制濃度50％INHIBITYCONCENTRATIONIC50。并進(jìn)一步分析蕨麻提取物對于我國HIV1臨床分離株和HIV假病毒的抑制作用。結(jié)果1、運(yùn)用有限稀釋共培養(yǎng)法成功地從個(gè)體艾滋病患者PBMCS中分離出多株病毒實(shí)現(xiàn)了微量HIV1的分離。2、分離得到的系列病毒在擴(kuò)大培養(yǎng)過程中總體呈增長趨勢說明采用此法分離的HIV毒株具有感染能力在相同分離及復(fù)制條件下各病毒在不同時(shí)間點(diǎn)產(chǎn)生的P24抗原含量存在差異說明個(gè)體內(nèi)各毒株的感染能力及復(fù)制能力具有差異。3、通過分析病人體內(nèi)毒株間ENV區(qū)中的V1V5區(qū)的氨基酸序列各生物性克隆HIV1毒株間存在氨基酸的變異、插入及缺失從基因水平證實(shí)了準(zhǔn)種理論。4、采用CCK8試劑檢測蕨麻提取物對PBMCS的CC50為925ΜGML對TZMB1細(xì)胞的CC50為1475ΜGML對MT4上的CC50為1634ΜGML使用CASY方法檢測的蕨麻提取物對TZMB1細(xì)胞的CC50為220ΜGML對MT4的CC50為1539ΜGML。5、蕨麻提取物在PBMCS和TZMB1和MT4細(xì)胞上對SF33的IC50分別是IC50分別為和402ΜGML、467ΜGML和617ΜGML對兩株我國臨床分離株的IC50平均為199ΜGML對于4株HIV假病毒的平均IC50為243ΜGML。結(jié)論1、采用有限稀釋、梯度稀釋病人PBMCS后共培養(yǎng)方法根據(jù)各梯度下陽性率可在某稀釋度下分離得到由單個(gè)感染的細(xì)胞產(chǎn)生的HIV1毒株即生物性克隆的HIV1毒株2、個(gè)體內(nèi)分離獲得的一系列的生物性克隆毒株復(fù)雜多樣在結(jié)構(gòu)和生物學(xué)性質(zhì)上存在差異3、蕨麻提取物在體外具有抗HIV1的作用蕨麻提取物對HIV1實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)株臨床分離株假病毒均有抑制作用其IC50在199到617之間。4、蕨麻提取物的抗HIV1作用機(jī)制不只為已知成分中報(bào)道的抑制HIV蛋白酶其有效部位群中可能存在作用于HIV生命周期中的進(jìn)入或者逆轉(zhuǎn)錄的過程的成分。

簡介：第一軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文慢性腦缺血大鼠認(rèn)知障礙與腦甲狀腺激素代謝關(guān)系研究姓名劉海云申請學(xué)位級別碩士專業(yè)神經(jīng)病學(xué)指導(dǎo)教師陸兵勛王群20060606中文摘要功能變化與甲狀腺激素水平的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)血清低T4水平者認(rèn)知功能下降的可能性為相對高T。水平者的雙倍；老年甲狀腺功能減退患者往往伴有認(rèn)知功能障礙，用外源性甲狀腺激素替代治療后，其甲狀腺功能及認(rèn)知功能均得到改善。最近一項(xiàng)研究證實(shí)亞臨床甲減患者經(jīng)甲狀腺激素替代治療后其韋氏記憶量表測評分值有明顯增高；成年甲減時(shí)大鼠海馬LTP產(chǎn)生不能，以及大鼠和人學(xué)習(xí)和記憶損害。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)TH通過對NRL和NR2BMRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)影響LTP的產(chǎn)生，進(jìn)而影響認(rèn)知功能；可以認(rèn)為認(rèn)知功能障礙的發(fā)生與甲狀腺激素代謝紊亂有一定聯(lián)系。測定腦梗塞患者腦脊液TH發(fā)現(xiàn)CSFFT。、FT。均顯著下降，臨床研究發(fā)現(xiàn)VD患者存在血清甲狀腺激素水平異常，主要表現(xiàn)為低T3綜合征，且其變化與癡呆程度密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈建立大鼠慢性腦供血不足模型，研究慢性腦缺血大鼠腦組織甲狀腺激素代謝變化特點(diǎn)，為系統(tǒng)性研究慢性腦缺血大鼠認(rèn)知功能改變與甲狀腺激素系統(tǒng)變化的關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)支持，為臨床VD的治療提供新的思路。研究方法第一部分慢性腦缺血大鼠認(rèn)知功能行為鋇4試一實(shí)驗(yàn)分組37只雄性成年SD大鼠隨機(jī)分四組假手術(shù)組單純手術(shù)組永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈5周；術(shù)后給藥組SR側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎后次日給予甲狀腺素20MG／日／只灌胃共5周；甲狀腺機(jī)能減低組含O15％PTU的低碘飼料喂養(yǎng)8周。二MORRIS水迷宮測試各組均于實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)進(jìn)行定位航行試驗(yàn)、空間探索試驗(yàn)及工作記憶測試。三統(tǒng)計(jì)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用SPSSL00統(tǒng)計(jì)軟件中的隨機(jī)方差分析ONEWAYANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，比較各組之間相關(guān)測試指標(biāo)差異。第二部分慢性腦缺血大鼠腦組織甲狀腺激素代謝變化一實(shí)驗(yàn)分組假手術(shù)組8只，單純手術(shù)組6只，術(shù)后給藥組6只，甲減II

簡介：研究目的檢驗(yàn)柴莪退熱制劑對病毒性上呼吸道感染發(fā)熱的治療效果與適當(dāng)?shù)慕o藥途徑。研究方法1臨床觀察觀察素體健康成人病毒性上呼吸道感染發(fā)熱患者120例，隨機(jī)單盲分成二組，治療組使用柴莪退熱栓，對照組使用消炎痛栓，分別觀察開始退熱時(shí)間、體溫首次降至正常時(shí)間、完全退熱時(shí)間及癥狀改善情況，總結(jié)對比臨床療效。2實(shí)驗(yàn)研究21體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以流感病毒甲1型FM1株感染NIH小鼠為研究對象，以臨床應(yīng)用的栓劑配制原浸膏為治療組，分經(jīng)口腔給藥及直腸給藥不同組別，設(shè)利巴韋林為實(shí)驗(yàn)對照組，并設(shè)病毒及空白對照組。觀察所有組別肺指數(shù)、肺指數(shù)抑制率、死亡率及死亡保護(hù)率，作為研究指標(biāo)，以評估各組療效。22體外實(shí)驗(yàn)以家兔兩種不同給藥途徑用藥后制備含藥血清，檢驗(yàn)血清在體外對病毒攻擊狗腎細(xì)胞致病變作用有無影響，明確其有無直接抗甲1型流感病毒作用。研究結(jié)果1臨床觀察部分治療組和對照組開始退熱時(shí)間分別為325和190小時(shí)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜005。體溫首次降至正常時(shí)間和完全退熱時(shí)間兩組治療效果相近，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。兩組治愈率分別為3833％、3667％，總有效率分別為8333％、8667％，兩組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。改善惡寒、口渴癥狀方面兩組有顯著性差異，治療組療效優(yōu)于對照組，其它癥狀改善無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。消炎痛栓較柴莪退熱栓更容易產(chǎn)生汗出加重癥狀。治療組中衛(wèi)氣同病證的治愈率375％，有效率875％，均高于衛(wèi)分證治愈率3571％，和有效率7857％，但兩種證型療效比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療組藥后痊愈的患者，癥狀和體征以舌紅苔黃或薄，脈象浮或滑，口渴明顯癥狀為主，藥后無效者多伴有舌暗或淡，苔膩，脈象細(xì)，口渴不欲飲等癥狀。研究過程中未發(fā)現(xiàn)臨床用藥劑量范圍內(nèi)柴莪退熱栓有明顯不良反應(yīng)的臨床癥狀。2實(shí)驗(yàn)研究部分利巴韋林、柴莪退熱制劑口腔小、中、大劑量及直腸給藥小、中、大劑量的肺指數(shù)抑制率分別為4302％、3430％、4884％、930％及2907％、3372％、3198％。陽性對照藥物利巴韋林的肺指數(shù)與病毒對照組相比，P＜001；受試藥物柴莪退熱制劑經(jīng)口腔中劑量組與病毒對照組相比，P＜001，余實(shí)驗(yàn)組與病毒對照組對比P值均大于005。各組肺指數(shù)均數(shù)分布病毒組＞口腔大劑量組＞直腸小劑量組＞直腸大劑量組＞直腸中劑量組＞口腔小劑量組＞利巴韋林組＞口腔中劑量組＞空白對照組?？谇淮髣┝拷M肺指數(shù)幾乎與病毒組持平。柴莪退熱制劑經(jīng)口大、中、小劑量組對甲1型FM1株流感病毒感染小鼠死亡保護(hù)率分別為2222％、5556％、4444％；延長生命率為1455％、5691％、2496％；柴莪制劑經(jīng)直腸給藥大、中、小劑量組為4444％、4444％、3333％，延長生命率為3017％、3329％、2288％；陽性對照藥利巴韋林組死亡保護(hù)率為6667％；延長生命率為7771％。由于經(jīng)肛直腸用藥途徑難以留藥，各不同劑量組肺指數(shù)及死亡保護(hù)率方面效果均欠佳。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)各用藥組均有毒性，稀釋無毒狀態(tài)下對病毒無直接殺傷作用，而利巴韋林組則有直接抗病毒作用。研究結(jié)論治療病毒性上呼吸道感染發(fā)熱，柴莪退熱制劑對于屬中醫(yī)理論中衛(wèi)分、氣分或衛(wèi)氣同病的證侯較為適應(yīng)，采用新劑型，經(jīng)直腸給藥，臨床療效可靠，與對照藥物消炎痛栓相比能較好緩解口渴、惡寒等癥狀，雖然退熱不如消炎痛栓迅速，但完全退熱時(shí)間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。臨床研究中未發(fā)現(xiàn)有不良反應(yīng)癥狀，提示臨床使用劑量范圍內(nèi)較為安全。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示口腔中劑量可能是較適合劑量，其對肺指數(shù)和死亡率均有明顯保護(hù)作用，療效近于利巴韋林組；經(jīng)口大劑量組效果最差，提示過量使用可能有毒性，經(jīng)口用藥劑量不宜過大；從肺指數(shù)和死亡保護(hù)率來看，藥物劑量在一定范圍內(nèi)藥效和藥物保留的多少的似乎呈正相關(guān)性；通過本研究，可給柴莪退熱栓治療病毒性上呼吸道感染發(fā)熱提供臨床及部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)研究過程中發(fā)現(xiàn)，對于小型動(dòng)物使用無創(chuàng)傷性長期直腸給藥的方法可行性差，因小型動(dòng)物直腸留藥困難，量不均，可重復(fù)性差，多次給藥不能保證給藥質(zhì)量，使以動(dòng)物模擬人的直腸栓劑給藥不能成立，可能更近似于模擬灌腸，不能達(dá)到繞過肝的首過效應(yīng)。應(yīng)當(dāng)采用其它方法，使研究更具科學(xué)性。

簡介：WU多瘤病毒W(wǎng)UPOLYOMAVIRUSWUPYV是新近從呼吸道分泌物中發(fā)現(xiàn)的多瘤病毒目前其臨床意義上不明確。為了解WUPYV在深圳和汕頭地區(qū)的感染情況以及WUPYV的分子生物學(xué)特征為該病毒的致病性、診斷等研究提供科學(xué)依據(jù)。本論文建立了WUVYV的篩查技術(shù)對WUPYV基因進(jìn)行了克隆及核酸序列測定在此基礎(chǔ)上原核表達(dá)了結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3和非結(jié)構(gòu)蛋白STAGSMALLTUMANTIGEN并進(jìn)行了初步抗原性分析。收集2006年6月2009年6月在深圳和汕頭地區(qū)采集的1509份呼吸道急性感染住院兒童咽拭子分泌物。經(jīng)核酸檢測其中17例17150911％為WUPYV核酸陽性均為4歲以下患兒男女比例116。17例WUPYV陽性病人的主要臨床癥狀表現(xiàn)為咳嗽、發(fā)熱、喘息等典型的呼吸道感染癥狀。臨床診斷為支氣管肺炎10例、喘肺3例、毛細(xì)支氣管炎2例上呼吸道感染1例皰疹性咽峽炎1例。所有WUPYV陽性病例中與其他病毒合并感染的有7例其中RSV4例IVA1例RHV1例ADV1例共同感染率為41。根據(jù)參考文獻(xiàn)及GENBANK中已知的全基因序列設(shè)計(jì)5對引物以WUPYV陽性病例的總核酸為模板PCR分段擴(kuò)增出WUPYV的C1、C2、C3、C4和C55個(gè)片段將它們分別連入具有氨芐青霉素抗性基因的PBMTEASY載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10經(jīng)篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)提取質(zhì)粒PCR鑒定之后測序通過GENBANK及BLAST比對拼接獲得WUPYV的全基因序列并提交至GENBANKACCESSIONNUMBERSGQ926975GQ926980。將獲得的6株WUPYV全基因序列基因全長3例為5228NT3例為5229NT與NCBI已經(jīng)公布的國內(nèi)外全基因序列進(jìn)行核酸序列比較分析發(fā)現(xiàn)毒株之間基因同源性均在98以上為高度保守病毒基因突變在015突變位點(diǎn)主要發(fā)生在非編碼區(qū)和VP1編碼區(qū)而VP2和STAG編碼區(qū)的突變相對較少。根據(jù)WUPYV全基因序列的測序結(jié)果設(shè)計(jì)引物以WUPYV陽性病例的總核酸為模板擴(kuò)增出VP1、VP2、VP3及STAG的全基因片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶BAMHI和XBAL消化后連入融合表達(dá)載體PGEX20T轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21DE3經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)了氨基端融合GST的目的蛋白。LABWKS蛋白分析軟件分析結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物的分子量分別為69520、63090、56158和49000與理論值相符。SDSPAGE后切下目的條帶用水將凝膠內(nèi)的目的蛋白浸出然后進(jìn)行血清免疫印跡結(jié)果顯示所表達(dá)的融合蛋白能識(shí)別抗VP1、VP2、VP3的抗體表明所表達(dá)的蛋白具有抗原性。為進(jìn)一步研究WUPYV的檢測和致病性研究奠定了良好基礎(chǔ)。

簡介：點(diǎn)擊查看更多狂犬病毒膠體金檢測試紙的制備與初步應(yīng)用.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：點(diǎn)擊查看更多TLR4免疫，而非乙型肝炎病毒活化，調(diào)節(jié)肝臟微環(huán)境促進(jìn)放射性肝病.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：漢灘病毒HANTAANVIRUSHTNV是引起我國腎綜合征出血熱HEMRHAGICFEVERWITHRENALSYNDROMEHFRS最主要的病原體。HFRS主要表現(xiàn)為發(fā)熱、出血、低血壓休克、腎臟衰竭和多臟器功能不全綜合征自1955年首例發(fā)病報(bào)告以來發(fā)病率和病死率居高不下一直是嚴(yán)重威脅我國人民生命健康的嚴(yán)重公共安全問題。HFRS的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明目前認(rèn)為病毒對內(nèi)皮細(xì)胞的直接損傷以及機(jī)體的免疫病理損害均參與了HTNV的致病過程尤其是機(jī)體免疫系統(tǒng)中免疫復(fù)合物的形成、炎性因子的大量分泌炎癥風(fēng)暴、細(xì)胞毒性T細(xì)胞的殺傷作用在HFRS的發(fā)病機(jī)制中扮演了極其重要的角色。炎癥小體INFLAMMASOMES是近年來發(fā)現(xiàn)的一類位于細(xì)胞內(nèi)、可以引起炎癥細(xì)胞因子IL1ΒIL18分泌、繼而誘發(fā)炎癥反應(yīng)的多聚蛋白復(fù)合體。炎癥小體識(shí)別的配體種類非常廣泛涵蓋了細(xì)菌、病毒、脂肪酸、結(jié)晶結(jié)構(gòu)等是機(jī)體固有免疫系統(tǒng)中重要的成份也是機(jī)體細(xì)胞抵抗外源病原體感染和消除內(nèi)源危險(xiǎn)因子刺激的首要免疫屏障。目前研究已知多種病毒感染靶細(xì)胞后均可以激活炎癥小體誘發(fā)局部的炎癥反應(yīng)以及后續(xù)的免疫反應(yīng)。與此同時(shí)病毒也使用了多種策略來逃逸炎癥小體的識(shí)別從而使自身能夠在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖。由于HTNV能夠刺激內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌IL1Β因此HTNV很有可能也激活了細(xì)胞內(nèi)的炎癥小體。因此我們檢測了HTNV感染THP1細(xì)胞后IL1Β的分泌以及NLRP3炎癥小體相關(guān)基因和蛋白水平的變化同時(shí)評價(jià)了CA2在HTNV感染過程中的作用。結(jié)果如下1我們首先構(gòu)建了HTNVCRNA標(biāo)準(zhǔn)品建立了熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測HTNV拷貝數(shù)的方法所得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)理想具有良好的線性關(guān)系。通過分析擴(kuò)增曲線和融解曲線發(fā)現(xiàn)該方法具有良好的敏感性、特異性以及重復(fù)性用其檢測THP1細(xì)胞培養(yǎng)上清中HTNV的病毒載量為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。2HTNV感染THP1細(xì)胞后可以引起PROIL1Β蛋白表達(dá)的增加以及IL1Β的分泌并且PROIL1Β蛋白表達(dá)的水平和IL1Β的分泌量與感染的病毒量呈正比。同時(shí)IL1Β的分泌需要病毒復(fù)制和增殖過程的誘導(dǎo)單純的病毒核酸及蛋白刺激均不能引起IL1Β分泌。3HTNV感染THP1細(xì)胞后可以引起炎癥相關(guān)基因的表達(dá)增高特別是NLRP3炎癥小體基因的表達(dá)增高并且NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白的表達(dá)也增高我們還用激光共聚焦顯微鏡檢測了NLRP3炎癥小體在HTNV感染THP1細(xì)胞后的定位情況分別從基因和蛋白水平證實(shí)了HTNV感染可以引起NLRP3炎癥小體的激活。此外我們使用NLRP3SIRNA和CASPASE1抑制劑進(jìn)一步驗(yàn)證了NLRP3炎癥小體在HTNV感染中的作用。4我們還檢測了活細(xì)胞內(nèi)游離CA2在THP1細(xì)胞中的變化情況發(fā)現(xiàn)HTNV感染THP1細(xì)胞會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)CA2濃度增高螯合細(xì)胞外CA2會(huì)導(dǎo)致IL1Β分泌的減少提示CA2有可能參與了NLRP3炎癥小體的激活過程。綜上所述我們發(fā)現(xiàn)HTNV感染THP1細(xì)胞可以激活NLRP3炎癥小體增加細(xì)胞內(nèi)游離的CA2的濃度啟動(dòng)下游CASPASE1和IL1Β信號(hào)通路最終導(dǎo)致IL1Β的分泌誘發(fā)局部的炎癥反應(yīng)。本研究為探索HTNV感染靶細(xì)胞的具體過程和機(jī)制提供了一些新的證據(jù)和思路。

簡介：蘇州大學(xué)學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明1748S42本人鄭重聲明所提交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不含其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不含為獲得蘇州大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位證書而使用過的材料。對本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人承擔(dān)本聲明的法律責(zé)任。論文作者簽名絲近匡1日期竺生壘蘭旦學(xué)位論文使用授權(quán)聲明本人完全了解蘇州大學(xué)關(guān)于收集、保存和使用學(xué)位論文的規(guī)定，即學(xué)位論文著作權(quán)歸屬蘇州大學(xué)。本學(xué)位論文電子文檔的內(nèi)容和紙質(zhì)論文的內(nèi)容一致。蘇州大學(xué)有權(quán)向國家圖書館、中國社科院文獻(xiàn)信息情報(bào)中心、中國科學(xué)技術(shù)信息研究所含萬方數(shù)據(jù)電子出版社、中國學(xué)術(shù)期刊光盤版電子雜志社送交本學(xué)位論文的復(fù)印件和電子文檔，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存和匯編學(xué)位論文，可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索。涉密論文口本學(xué)位論文屬在年月解密后適用本規(guī)定。非涉密論文口‘論文作者簽名導(dǎo)師簽名EL期絲＆拿蘭目EL期衛(wèi)啤珥丑一∑蓉

簡介：乙型肝炎病毒HBV，HEPATITISBVIRUS感染是常見的傳染性疾病之一，不僅能引起急、慢性病毒性肝炎而且與肝纖維化、肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)嚴(yán)重威脅人類的健康。目前，治療乙肝的藥物主要有兩類干擾素與核苷類似物。干擾素IFN是由干擾素誘生劑誘導(dǎo)生物細(xì)胞后所產(chǎn)生的一類高活性多功能的糖蛋白。1976年GREENBERG等首先報(bào)道用人白細(xì)胞干擾素治療4例慢性活動(dòng)性乙肝治療后有2例HBEAG消失。此后，干擾素一直被視為治療乙肝的首選藥物，且在歐洲取得了較滿意的治療效果。在亞洲，僅有2030％的乙肝患者對干擾素治療敏感。前人報(bào)導(dǎo)干擾素可以調(diào)節(jié)肝細(xì)胞中MICRNA122的表達(dá)，且MICRNA122與HBV息息相關(guān)。本文通過REALTIMEPCRNANO等方法旨在于研究MICRNA122介導(dǎo)干擾素抗HBV復(fù)制的可能機(jī)制。首先，通過用IFNΑ體外處理HUH7細(xì)胞，QRTPCR檢測HUH7細(xì)胞中MICRNA122表達(dá)量的變化，發(fā)現(xiàn)1000IUMLIFNΑ可以顯著下調(diào)細(xì)胞中MICRNA122的表達(dá)。其次，本文成功構(gòu)建PSUPERMIR122真核表達(dá)載體。用PSUPERMIR122或MIR122MIMIC與PHBV13轉(zhuǎn)染HEPG2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)MIR122在體外可以抑制HBV的復(fù)制。同時(shí)，用MIR122INHIBIT與HBV13轉(zhuǎn)染HUH7細(xì)胞，結(jié)果表明MIR122INHIBIT在HUH7細(xì)胞中具有促進(jìn)HBV復(fù)制的作用。兩項(xiàng)結(jié)果分別從正反面表明MIR122在體外可抑制HBV的復(fù)制。再次，為了探求為什么MIR122能抑制HBV，HBV13LUCI報(bào)告基因與MIR122共轉(zhuǎn)染HUH7細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)MIR122可能作用于HBVC的5‵非編碼區(qū)。最后，本研究對干擾素、HBV與MIR122進(jìn)行了綜合實(shí)驗(yàn)分析，得出MIR122負(fù)向調(diào)節(jié)IFN抗HBV復(fù)制的結(jié)論。這個(gè)結(jié)果對于治療乙肝提供了一條新的方案，主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面一、也許可以通過某種方法抵消MIR122在IFN抗HBV復(fù)制過程中所起到的負(fù)調(diào)控作用而增強(qiáng)IFN治療乙肝的能力。二、可以從MIR122自身出發(fā)設(shè)計(jì)RNA藥物，直接進(jìn)行乙肝治療。

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簡介：目的通過對乙型肝炎病毒疫苗接種后不同免疫應(yīng)答人群T細(xì)胞亞群、T調(diào)節(jié)細(xì)胞、外周血單個(gè)核細(xì)胞在PHA和HBSAG干預(yù)前后FOXP3MRNA的表達(dá)和細(xì)胞因子分泌情況的檢測，探討乙型肝炎病毒疫苗接種后免疫應(yīng)答與T細(xì)胞亞群活化、免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞和細(xì)胞因子之間的內(nèi)在聯(lián)系。方法對1024名大專生乙型肝炎病毒血清學(xué)標(biāo)志物進(jìn)行初篩，選取其中無任何血清學(xué)標(biāo)志物的個(gè)體進(jìn)行常規(guī)重組酵母乙型肝炎病毒疫苗接種，全程接種完后45日行HBV血清學(xué)檢查。選取其中18例乙型肝炎病毒疫苗接種后HBSAB陽性者作為應(yīng)答組，22例乙型肝炎病毒疫苗接種HBSAB陰性者作為無應(yīng)答組，10例未接受乙型肝炎病毒疫苗接種的健康對照者作為對照組。采集不同反應(yīng)人群全血，用流式細(xì)胞術(shù)對其外周血單核細(xì)胞的表面標(biāo)志物CD69、CD4、CD8、CD25等進(jìn)行檢測，計(jì)算不同T細(xì)胞亞群百分比，如CD69、CD4、CD8T細(xì)胞百分比及CD4CD25TREG細(xì)胞數(shù)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測人外周血單個(gè)核細(xì)胞在PHA和HBSAG刺激前后FOXP3MRNA的表達(dá)；酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測不同反應(yīng)人群外周血單個(gè)核細(xì)胞PHA和HBSAG刺激后IL4、IL12、IL18、IFNΓ的分泌情況。結(jié)果1通過酶聯(lián)免疫吸附法檢測2006級大專生1024人，其中血清無任何標(biāo)志物的有405人，乙型肝炎病毒攜帶率為17％。全程接種乙型肝炎病毒疫苗后乙肝血清學(xué)顯示男、女生無、弱應(yīng)答率之間無顯著性差異；約65％免疫應(yīng)答個(gè)體的乙肝表面抗體滴度屬于高反應(yīng)組。2應(yīng)答組、無應(yīng)答組、對照組CD4CD69T細(xì)胞占CD4T細(xì)胞的百分比分別為181±133％、064±048％、和056±039％，應(yīng)答組CD4T細(xì)胞中CD69的表達(dá)明顯高于對照組P005。各組CD8CD69T細(xì)胞占CD8±T細(xì)胞的百分比分別為043±025％、305±169％、和311±241％，應(yīng)答組與對照組和無應(yīng)答組比較，差異均有非常顯著性意義P3應(yīng)答組、無應(yīng)答組、對照組CD3CD4T細(xì)胞占CD3T細(xì)胞的百分比分別為5084±636％、5367±668％和5102±930％，各組結(jié)果比較，差異沒有顯著性意義P005；各組CD3CD8T細(xì)胞占CD3T細(xì)胞的百分比分別為4102±441％、4269±735％、和4236±834％，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間結(jié)果的差異無顯著性意義P005。4應(yīng)答組、無應(yīng)答組、對照組CD4CD25TREG細(xì)胞占CD4T細(xì)胞的百分比分別為059±046％、077±040％、和130±144％，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間結(jié)果的差異無顯著性意義P005。5實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測應(yīng)答組、無應(yīng)答組、對照組外周血單個(gè)核細(xì)胞FOXP3的表達(dá)。PHA和HBSAG刺激前，F(xiàn)OXP3的表達(dá)在應(yīng)答組和無應(yīng)答組、對照組相比，其差異有顯著性意義P005，兩者之間沒有顯著性差異；應(yīng)答組與對照組相比，兩者之間存在顯著性差異P6應(yīng)答組、無應(yīng)答組、對照組外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)PHA和HBSAG刺激后應(yīng)答組與無應(yīng)答組、應(yīng)答組與對照組IFNΓ的濃度相比較，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P005。結(jié)論120ΜG每次全程乙型肝炎病毒疫苗接種后無應(yīng)答率為55％，在應(yīng)答人群中，弱應(yīng)答率為13％，中應(yīng)答率為22％，強(qiáng)應(yīng)答率為65％。2乙型肝炎病毒疫苗接種后無應(yīng)答與TH細(xì)胞早期活化不足、TS細(xì)胞活化增加有關(guān)。3CD4CD25FOXP3TREG細(xì)胞在一定程度上參與了乙肝疫苗接種應(yīng)答的負(fù)性調(diào)控。4乙型肝炎病毒疫苗接種后無應(yīng)答與IFNΓ分泌不足有關(guān)。

簡介：手足口病H，F(xiàn)OOT，MOUTHDISEASEHFMD是一種兒童流行性傳染病，主要表現(xiàn)為手、足和口腔粘膜的皰疹。手足口病疫情近年在亞太地區(qū)呈上升趨勢，其病原為多種腸道病毒，包括腸道病毒71型，柯薩奇病毒A組（2，4，5，6，9，10，16型）、柯薩奇病毒B組（2，5型）以及?？刹《镜?。通常情況下，各種腸道病毒感染引起的HFMD在體征和臨床癥狀方面難以區(qū)別，但由于EV71感染引起的HFMD容易導(dǎo)致心肌炎、腦干腦炎、無菌性腦膜炎、脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹等多種嚴(yán)重并發(fā)癥，有較高的病死率及致殘率，所以早期特異性檢測和確診HFMD為何種腸道病毒感染對臨床治療有重要意義。2012年812月，江西九江爆發(fā)手足口病，本實(shí)驗(yàn)室共收集到704份（每人一份）手足口病咽拭子標(biāo)本和200份病人血清，通過RTPCR檢測咽拭子標(biāo)本，證實(shí)為柯薩奇病毒A6型COXSACKIEVIRUSA6，CVA6感染，確認(rèn)這次爆發(fā)為CVA6所致。2012年以后我國CVA6引起的手足口病不斷增多，已逐漸成為引起手足口病爆發(fā)的主要病原之一。CVA6為單股正鏈小RNA病毒科（PICNAVIRIDAE）、腸道病毒屬ENTEROVIRUS成員。與其他柯薩奇病毒一樣，CVA6病毒顆粒為二十面體立體對稱球形，無包膜和突起。其編碼的多聚蛋白經(jīng)自身蛋白酶水解為P1、P2和P3三種前體蛋白。P1區(qū)編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白VP1～4，組成病毒衣殼。以往研究認(rèn)為，VP1蛋白是小RNA病毒主要的中和決定因子，是特異性中和表位的所在區(qū)域，直接決定病毒的抗原性。因此，VP1蛋白也是小RNA病毒疫苗和診斷試劑研制的主要對象。本論文對CVA6主要結(jié)構(gòu)蛋白VP1的表位鑒定以及抗原特性進(jìn)行研究，旨在為CVA6的疫苗研制和血清學(xué)診斷試劑的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。研究結(jié)果主要分為以下兩個(gè)部分一、CVA6結(jié)構(gòu)蛋白VP1的大腸桿菌表達(dá)、單克隆抗體的制備及抗原特性分析為了研究CVA6結(jié)構(gòu)蛋白VP1的抗原特性，我們采用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)CVA6VP1重組蛋白，蛋白純化后，以VP1重組蛋白作為抗原，通過間接ELISA法分析與抗CVA6血清的反應(yīng)性及與CVA16、EV71血清的交叉反應(yīng)性，評價(jià)其免疫反應(yīng)性。利用VP1重組蛋白免疫BALBC小鼠，制備了一系列單克隆抗體。通過間接ELISA檢測單抗與CVA6、EV71和CVA16的VP1蛋白的免疫反應(yīng)性。結(jié)果如下A利用基因重組技術(shù)成功構(gòu)建了含CVA6VP1全長基因的PET28A重組質(zhì)粒，并在大腸桿菌中能高效表達(dá)CVA6VP1重組蛋白，重組蛋白主要以包涵體形式表達(dá)，根據(jù)表達(dá)蛋白所攜帶的蛋白標(biāo)簽，利用鎳離子金屬螯合親和層析技術(shù)獲得純化蛋白。BCVA6VP1重組蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性，能與CVA6病毒免疫的小鼠血清呈現(xiàn)良好的反應(yīng)性，但與EV71、CVA16血清之間有顯著的交叉反應(yīng)。C利用CVA6VP1重組蛋白免疫小鼠，制備了4株單克隆抗體，利用間接ELISA法分析顯示，4株單抗均可與CVA6VP1蛋白反應(yīng)，其中一株單抗6C1可同時(shí)與EV71VP1重組蛋白和CVA16VP1反應(yīng)，兩株單抗5A8，4A3不與EV71VP1反應(yīng)，但與CVA16VP1反應(yīng)，一株單抗7B2為抗HIS標(biāo)簽的單抗。二、CAV6結(jié)構(gòu)蛋白的抗原表位的定位與分析為進(jìn)一步研究CVA6VP1蛋白的抗原表位的定位，我們采用重組抗原MAPPING策略，表達(dá)了一系列長度不同、大小不等的重組肽段。以各VP1截短蛋白作為抗原，通過間接ELISA法分析與所制備的CAV6VP1單克隆抗體的免疫反應(yīng)性，評價(jià)其免疫反應(yīng)性和特異性，結(jié)果如下A利用基因重組技術(shù)成功表達(dá)了一系列截短的CVA6VP1重組蛋白，分別為CVA6VP11305、CVA6VP110305、CVA6VP162305、CVA6VP187305、CVA6VP1115305、CVA6VP1145305。均以包涵體形式表達(dá)。B可以識(shí)別CVA6、EV71和CVA16VP1重組蛋白的單克隆抗體6C1，可以被CVA6VP1截短蛋白CVA6VP11305、CVA6VP110305識(shí)別，但不與CVA6VP162305、CVA6VP187305、CVA6VP1115305、CVA6VP1145305反應(yīng)，說明CVA6VP1蛋白N端1062AA區(qū)段含有腸道病毒EV71、CVA6和CVA16共同性表位。C可以識(shí)別CVA16VP1重組蛋白，但不識(shí)別EV71VP1重組蛋白的兩株單克隆抗體5A8、4A3，可以被CVA6VP1截短蛋白CVA6VP11305、CVA6VP110305、CVA6VP162305反應(yīng)，但不與CVA6VP187305、CVA6VP1115305、CVA6VP1145305反應(yīng)，說明，CVA6VP1蛋白N端6287AA區(qū)段含有柯薩奇病毒（CVA6和CVA16）的共同性表位。D綜上所述，我們的研究結(jié)果表明1CVA6結(jié)構(gòu)蛋白VP1及其截短蛋白片段在大腸桿菌中以包涵體形式表達(dá)2CVA6結(jié)構(gòu)蛋白VP1有很強(qiáng)的免疫反應(yīng)性，但與EV71、CVA16的抗血清有顯著的交叉反應(yīng)性，所以不宜作為診斷抗原進(jìn)行CVA6血清學(xué)的特異性檢測3CVA6VP1蛋白N端1062AA區(qū)段含有腸道病毒CVA6、EV71和CVA16的共同性表位。4CVA6VP1蛋白N端6287AA區(qū)段含有柯薩奇病毒CVA6和CVA16的共同性表位。遺憾的是，我們并沒有制備出可以特異性識(shí)別CVA6而不識(shí)別EV71以及CVA16的單抗，所以沒有辦法進(jìn)一步定位具有特異性抗原表位的位置，只能留給以后再繼續(xù)研究。上述研究結(jié)果豐富了我們對CVA6的認(rèn)識(shí)，將對未來基于CVA6VP1的研究工作提供幫助。

簡介：第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文抑郁癥患者認(rèn)知功能的事件相關(guān)電位研究姓名呂靜申請學(xué)位級別碩士專業(yè)應(yīng)用心理學(xué)指導(dǎo)教師王家同20050501抑郁癥患者認(rèn)知功能的事件相關(guān)電位研究研究生呂靜學(xué)科專業(yè)應(yīng)用心理學(xué)所在單位第四軍醫(yī)大學(xué)航空航天醫(yī)學(xué)系導(dǎo)師王家同教授輔導(dǎo)教師趙侖副教授資助基金項(xiàng)目全軍醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金項(xiàng)目編號(hào)01L072關(guān)鍵詞抑郁癥事件相關(guān)電位關(guān)聯(lián)性負(fù)變面孔識(shí)別選擇注意中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)2005年05月

簡介：目的構(gòu)建原核表達(dá)系統(tǒng)對狂犬病毒RVCVS株的核蛋白NP進(jìn)行表達(dá)和純化，并在大腸桿菌中表達(dá)對其進(jìn)行初步的抗原性檢測。表達(dá)的目的蛋白為進(jìn)一步研發(fā)狂犬血清學(xué)檢測試劑盒提供抗原。方法以重組質(zhì)粒TEASYRVNP為模板，利用PCR方法擴(kuò)增狂犬病毒RVCVS株核蛋白NP的DNA片段，并重組入原核高效表達(dá)載體PET15B。用酶切電泳驗(yàn)證重組結(jié)果的正確性并通過測序檢查質(zhì)粒重組后序列有無變化。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目蛋白進(jìn)行表達(dá)。研究誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)劑濃度等對表達(dá)蛋白量的影響，對蛋白表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。并對表達(dá)得到得包涵體蛋白進(jìn)行了洗滌。后用SDSPAGE與WESTERNBLOT鑒定其抗原性。結(jié)果經(jīng)過篩選得到含狂犬病毒N基因片斷的原核表達(dá)載體，測序檢查證明目的基因序列無變化。獲得表達(dá)狂犬病毒核蛋白的重組菌，IPTG誘導(dǎo)后SDSPAGE電泳結(jié)果表明，在51KDA，處有一條蛋白表達(dá)帶，大小與預(yù)期相符。WESTERNBLOT分析證明，51KDA蛋白帶可與抗體血清發(fā)生特異性反應(yīng)。WESTERNBLOT鑒定表明重組蛋白有良好的抗原性和特異性。結(jié)論成功構(gòu)建了PET15BNP原核表達(dá)載體，表達(dá)產(chǎn)物為狂犬病毒核蛋白，初步洗滌了包涵體蛋白，為生產(chǎn)純度高且價(jià)廉的RVNP抗原奠定了基礎(chǔ)。為進(jìn)一步研發(fā)狂犬血清學(xué)檢測試劑盒提供抗原，為制備測定RVNP抗體的免疫診斷試劑提供了條件。

簡介：目的丙型肝炎病毒HEPATITISCVIRUS，HCV于1989年被CHOO等發(fā)現(xiàn)，到目前為止，全球約有17億人感染，占世界人口的2～3％。我國也是丙型肝炎高發(fā)區(qū)，健康人群中抗HCV陽性率為32％。HCV感染的慢性化率較高，由此增加了發(fā)展為肝纖維化、肝硬化和肝細(xì)胞癌HEPATOCELLULARCARCINOMA，HCC及其他相關(guān)致死性肝病的風(fēng)險(xiǎn)。丙型肝炎病毒HCV屬黃病毒科，基因組為單股正鏈RNA，含有一個(gè)開放閱讀框，編碼一個(gè)多聚蛋白前體，后者在病毒自身蛋白酶和宿主蛋白酶的作用下被切割為結(jié)構(gòu)蛋白CE、E1、E2、P7，和非結(jié)構(gòu)蛋白NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B一共10種病毒蛋白。作為連接HCV結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白關(guān)鍵部分的NS2蛋白一直是研究的熱點(diǎn)，其氨基端依賴于宿主信號(hào)肽切割，羧基端則由NS2NS3蛋白酶催化自身切割與NS3分離而釋放。釋放出的具有功能的NS2蛋白為病毒感染細(xì)胞所必需，還可參與調(diào)控宿主細(xì)胞的增殖和基因表達(dá)。ERDTMANN等發(fā)現(xiàn)NS2與肝臟特異的促凋亡因子CIDEBCELLDEATHINDUCINGDFFALIKEEFFECTB相互作用，抑制CIDEB誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。NS2還可抑制IFNΒ基因啟動(dòng)子的活性，從而阻止宿主體內(nèi)信號(hào)通路發(fā)揮抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等作用。本研究應(yīng)用HCV2A型JFH1株基因?yàn)槟０?，?gòu)建了HCVNS2真核表達(dá)質(zhì)粒PEGFPC1NS2，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人肝細(xì)胞株L02，并獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的單克隆株，從對L02增殖水平及所分泌細(xì)胞因子的影響角度了解NS2對宿主細(xì)胞的作用。肝臟中存在枯否氏細(xì)胞（巨噬細(xì)胞）、NK細(xì)胞等固有免疫細(xì)胞，它們在機(jī)體抗病毒感染中發(fā)揮著重要的作用，但多個(gè)研究表明，HCV在肝臟微環(huán)境中可通過自身蛋白干擾免疫細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制免疫應(yīng)答，有利于持續(xù)存在于宿主體內(nèi)。本研究通過應(yīng)用TRANSWELL小室將轉(zhuǎn)染NS2基因的L02細(xì)胞與人巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，從不同水平檢測巨噬細(xì)胞變化，旨在研究HCVNS2蛋白、肝細(xì)胞、巨噬細(xì)胞三者在肝臟微環(huán)境中的相互作用，以期為以HCV為基礎(chǔ)的肝細(xì)胞癌發(fā)生機(jī)制和HCV免疫逃逸研究提供新的視角。方法1、從JFH1株HCV2A全長基因質(zhì)粒上通過PCR方法擴(kuò)增HCVNS2基因，連接至PMD18T載體，測序正確后，經(jīng)BAMHⅠ、HINDⅢ雙酶切，將其克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒PEGFPC1，構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒PEGFPC1NS2，經(jīng)HINDⅢ、BAMHⅠ雙酶切后瓊脂糖電泳鑒定并測序。2、分別提取及純化PEGFPC1VECT和PEGFPC1NS2質(zhì)粒，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞株L02并G418藥物篩選，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的單克隆細(xì)胞L02PEGFPC1VECT和L02PEGFPC1NS2。通過熒光顯微鏡觀察GFP蛋白熒光強(qiáng)度，提取細(xì)胞總RNA后PCR檢測目的基因GFPNS2，提取細(xì)胞總蛋白行WESTERNBLOT檢測GFPNS2融合蛋白的表達(dá)以鑒定。3、體外培養(yǎng)L02、L02PEGFPC1VECT和L02PEGFPC1NS2三種細(xì)胞，待對數(shù)生長期，消化計(jì)數(shù)后接種于96孔板（1104個(gè)孔），分別于培養(yǎng)24H，48H，72H時(shí)，每孔加入MTS溶液20ΜL，37℃培養(yǎng)箱孵育4H，吸取孔內(nèi)培養(yǎng)液，用酶標(biāo)儀檢測490NM處的吸光度值，MTS法檢測不同時(shí)間點(diǎn)肝細(xì)胞增殖的動(dòng)態(tài)變化。4、體外培養(yǎng)L02、L02PEGFPC1VECT、L02PEGFPC1NS2三種細(xì)胞，待對數(shù)生長期，消化計(jì)數(shù)后接種于6孔板（1106個(gè)孔），24H后提取細(xì)胞總RNA，REALTIMEPCR檢測細(xì)胞因子（IL8、IL10、TGFΒ）MRNA水平變化。5、將L02、L02PEGFPC1VECT、L02PEGFPC1NS2三種細(xì)胞，與巨噬細(xì)胞THP1共培養(yǎng)，并設(shè)單獨(dú)培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞THP1為對照。于共培養(yǎng)6H、10H后，收取巨噬細(xì)胞THP1提取總RNA，REALTIMEPCR檢測細(xì)胞因子（IL1Β、IL8、IL10、TGFΒ）MRNA水平變化于共培養(yǎng)12H、24H后，取巨噬細(xì)胞THP1上清，使用CBAHUMANINFLAMMATYCYTOKINESKIT檢測巨噬細(xì)胞THP1分泌的炎性細(xì)胞因子的變化于共培養(yǎng)12H、24H后，收取巨噬細(xì)胞THP1提取細(xì)胞總蛋白，WESTERNBLOT檢測細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子STAT3、磷酸化STAT3的活性。結(jié)果1、成功構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒PEGFPC1NS2，經(jīng)HINDⅢ、BAMHⅠ雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳鑒定有約650BP大小片段存在，測序結(jié)果顯示與GENBANK記載序列一致。2、獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的單克隆細(xì)胞L02PEGFPC1VECT和L02PEGFPC1NS2。經(jīng)PCR檢測L02PEGFPC1NS2組中有目的基因GFPNS2的表達(dá)，WESTERNBLOT檢測結(jié)果顯示有GFPNS2融合蛋白的表達(dá)。3、L02細(xì)胞增殖曲線顯示，L02細(xì)胞組、L02PEGFPC1VECT細(xì)胞組和L02PEGFPC1NS2細(xì)胞組，三組細(xì)胞之間增殖水平無差別P＞005。4、L02細(xì)胞REALTIMEPCR結(jié)果顯示L02PEGFPC1NS2細(xì)胞組抑炎因子IL10、TGFΒMRNA水平較L02細(xì)胞組和L02PEGFPC1VECT細(xì)胞組升高（P＜005）與L02組比較，L02PEGFPC1VECT細(xì)胞組和L02PEGFPC1NS2細(xì)胞組促炎因子IL8MRNA表達(dá)水平降低，但轉(zhuǎn)質(zhì)粒兩組間無差異P＞005。5、THP1細(xì)胞REALTIMEPCR結(jié)果顯示，與L02PEGFPC1NS2共培養(yǎng)6H后THP1細(xì)胞中細(xì)胞因子IL1Β、IL8、TGFΒMRNA水平高于其他三個(gè)對照組P＜005細(xì)胞因子IL10在四組之間無差異P＞005而在共培養(yǎng)10H后，與L02PEGFPC1NS2共培養(yǎng)的THP1細(xì)胞中IL10MRNA水平高于其他三個(gè)對照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜005。6、CBA結(jié)果顯示，THP1與L02PEGFPC1NS2共培養(yǎng)12H、24H后其上清中細(xì)胞因子IL6、IL1Β、TNF、IL10均顯著高于其他三個(gè)對照組（P＜005）。7、L02、L02PEGFPC1VECT、L02PEGFPC1NS2三種細(xì)胞，與巨噬細(xì)胞THP1共培養(yǎng)12H、24H后，提取巨噬細(xì)胞THP1蛋白，WESTERNBLOT顯示STAT3總量及磷酸化STAT3表達(dá)無明顯改變。結(jié)論1、成功構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒PEGFPC1NS2，并獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的單克隆細(xì)胞L02PEGFPC1VECT和L02PEGFPC1NS2。2、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HCVNS2的L02細(xì)胞抑炎因子IL10和TGFΒMRNA表達(dá)增高。3、與轉(zhuǎn)染HCVNS2基因的L02細(xì)胞共培養(yǎng)，可促巨噬細(xì)胞炎癥因子IL1Β、IL6、IL8和負(fù)調(diào)節(jié)因子IL10、TGFΒ在MRNA水平或蛋白水平表達(dá)增高。