簡(jiǎn)介：目的探討腺病毒介導(dǎo)的HIL10對(duì)大鼠肝損傷的保護(hù)作用。在體外細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)中探究腺病毒介導(dǎo)的人白細(xì)胞介素10HIL10是否能對(duì)損傷的培養(yǎng)肝細(xì)胞發(fā)揮抗炎保護(hù)作用在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中探究攜帶HIL10基因的腺病毒的轉(zhuǎn)染效率以及對(duì)損傷的大鼠肝組織有保護(hù)作用。方法首先構(gòu)建攜帶HIL10的腺病毒載體。在體外實(shí)驗(yàn)中先利用四氯化碳CCL4誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷模型并在實(shí)驗(yàn)保護(hù)組細(xì)胞中先加入腺病毒載體培養(yǎng)24小時(shí)觀察細(xì)胞存活率。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中向CCL4誘導(dǎo)的肝損傷模型大鼠尾靜脈中注射包含腺病毒介導(dǎo)的HIL10的林格液觀察其與對(duì)照組大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT、谷草轉(zhuǎn)氨酶AST、肝纖維化四項(xiàng)指標(biāo)血清透明質(zhì)酸、層粘連蛋白、III型前膠原、IV型膠原以及病理結(jié)果對(duì)比以增強(qiáng)綠色熒光蛋白EGFP作為熒光標(biāo)記觀察腺病毒的轉(zhuǎn)染效率并使用ELISAWESTERNBLOT檢測(cè)HIL10在大鼠血漿內(nèi)的表達(dá)情況。結(jié)果在體外實(shí)驗(yàn)中大鼠肝細(xì)胞加入CCL4至終濃度05MOLL后細(xì)胞出現(xiàn)明顯的損傷細(xì)胞存活率下降至59％至72之間與空白對(duì)照組相比差異具有顯著性P結(jié)論腺病毒介導(dǎo)的HIL10對(duì)肝損傷大鼠有較好的保護(hù)作用而且此技術(shù)很安全。所以腺病毒介導(dǎo)的HIL10對(duì)肝損傷以及肝纖維化的治療有廣闊的應(yīng)用前景。

簡(jiǎn)介：東北師范大學(xué)碩士學(xué)位論文認(rèn)知負(fù)載與記憶痕衰退對(duì)成人空間工作記憶廣度的影響姓名王國(guó)明申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)基礎(chǔ)心理學(xué)指導(dǎo)教師張明20050501ABSTRACTTHESPANOFWORKINGMEMORYWASONEOFTHEFUNDAMENTALPROBLEMSINWORKINGMEMORYITWASDEFINEDTHENUMBERSORUNITSOFPREVIOUSLEARNINGITEMSTHATPARTICIPANTSCOULDCORRECTIVELYREMINDINASPECIFICTASKORAPARADIGMOFTHESPANOFWORKINGMEMORYTHESPANOFWORKINGMEMORYWASLIMITEDSOTHATTHERESOURCESHARINGTHEORYANDTHETRAILOFMEMORYTHEORYCOMPETITIVELYTRIEDTOEXPLAINTHEREASONOFLIMITATIONOFCOGNITIVERESOURCESUCHTWOTHEORIESEXISTEDGREATDIVERGENCEONTHEQUESTIONTHERESEARCHWASTOEXPLORETHEEFFECTOFCOGNITIVELOADANDTHETRAILOFMEMORYONTHESPANOFWORKINGMEMORYBYUSINGTHEPARADIGMOFSPATIALWORKINGMEMORYWITHSETTINGDIFFERENTCOGNITIVELOADANDLONGORSHORTPROCESSINGTIMEEXPERIMENT1USINGTHEPARADIGMOFINDEPENDENTSPATIALWORKINGMEMORYTASKWASTOCOMPARETHEEFFECTSOFDIFFERENTCOGNITIVELOADONTHESPANOFSPATIALWORKINGMEMORYOFPARTICIPANTSWHENTHEPROCESSINGTIMEISCONSTANTTHERESULTSSUGGESTEDCOGNITIVELOADSIGNIFICANTLYAFFECTSTHESPANOFSPATIALWORKINGMEMORYOFPARTICIPANTSEXPERIMEM2INVESTIGATESTHEEFFECTSOFHI曲ORLOWCOGNITIVELOADONTHESPANOFSPATIALWORKINGMEMORYWHENTHEPROCESSINGTIMEISCONSTANTBYTAKINGADVANTAGINGOFTHEPARADIGMOFDEPENDENTSPATIALWORKINGMEMORYITSHOWEDTHECOGNITIVELOADCOULDINFLUENCETHEPERFORMANCEOFPARTICIPANTSONTHETASKOFTHESPANOFSPATIALWORKINGMEMORYEXPERIMENT3FOUNDTHATCOGNITIVELOADINFLUENCEDPERFORMANCEOFPARTICIPANTSINTHETASKOFSPATIALWORKINGMEMORYRATHERTHANTHEPROCESSINGTIMEWHENWEMANIPULATEDSIMULTANEOUSLYTHECOGNITIVELOADANDPROCESSINGTIMESUCHTHESERESULTSFURTHEREXPANDINGTHEEXPLANATIONOFTIMEBASEDRESOURCESHARINGMODELKEYWORDSTHESPANOFSPATIALWORKINGMEMORY；COGNITIVELOAD；SHARINGRESOURCETHEORY；THETRAILOFMEMORYTRACE；PROCESSINGTIME1L

簡(jiǎn)介：乙型病毒性肝炎仍是一個(gè)世界性的公共衛(wèi)生問題，全球范圍內(nèi)乙型肝炎病毒HEPATITISBVIRUS，HBV的慢性感染人群高達(dá)35億以上。HBV相關(guān)的慢加急性肝衰竭ACUTEONCHRONICLIVERFAILURE，ACLF是慢性肝炎患者死亡的重要原因，如果不進(jìn)行肝移植，其死亡率高達(dá)6080％，每年大約有22600的患者死于肝衰竭。長(zhǎng)期以來宿主免疫一直被認(rèn)為是乙型肝炎加劇的主要原因，但是近年的研究結(jié)果表明病毒因素在ACLF的發(fā)病中同樣起重要作用。HBV是嗜肝病毒家族的一員，其DNA全長(zhǎng)約為3200個(gè)核苷酸，呈現(xiàn)部分雙鏈環(huán)狀。HBV基因組包含4個(gè)相互重疊的開放性讀碼框，分別編碼HBV表面抗原、核心抗原、聚合酶和多功能的非結(jié)構(gòu)性蛋白X。由于HBV的復(fù)制過程包含前基因組RNA的逆轉(zhuǎn)錄，其逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏校正功能，故HBV的突變率顯著高于其它的DNA病毒。HBV基因組的突變率可隨著病毒的復(fù)制不斷增加，其中一些突變可能與慢性肝炎的急性加劇相關(guān)，可作為ACLF的預(yù)警的生物標(biāo)志物和抗病毒治療的靶標(biāo)。近來有研究表明基本核心啟動(dòng)子區(qū)的A1762TG1764A突變與ACLF發(fā)病相關(guān)，A1846T、G1896A和C1913AG位點(diǎn)的突變?cè)贏CLF患者中發(fā)生率顯著高于慢性肝炎患者。目前關(guān)于HBV突變和ACLF發(fā)病的關(guān)系主要集中于基本核心啟動(dòng)子區(qū)和前核心區(qū)，對(duì)HBV基因其它部位的研究尚少。ACLF是否有另外的一些HBV突變位點(diǎn)與ACLF發(fā)病有關(guān)尚不清楚，為此本研究用HBV全基因組測(cè)序篩選出與ACLF發(fā)病相關(guān)的HBV突變，并發(fā)現(xiàn)一些新的突變位點(diǎn)，經(jīng)過擴(kuò)大樣本的驗(yàn)證，以期為ACLF的預(yù)警提供依據(jù)。方法1HBV全基因測(cè)序篩選與ACLF發(fā)病可能相關(guān)的HBV突變位點(diǎn)11ILLUMINA高通量測(cè)序。樣本來自兩組12例ACLF和12例慢性輕度乙型肝炎MILDCHRONICHEPATITISB，CHBM年齡配對(duì)、性別和基因型分布無顯著差異患者，所有樣本HBV的DNA水平均＞100，000COPIESML。首先從200ΜL的血清中提取病毒DNA，分3段重疊擴(kuò)增HBV全基因組。PCR產(chǎn)物在GENOMEANALYZERⅡ平臺(tái)上進(jìn)行高通量測(cè)序，然后處理高通量測(cè)序數(shù)據(jù)。12檢測(cè)上述樣本的肝功能指標(biāo)ALT，AST，TBIL，PTA，HBV血清標(biāo)記物和HBVDNA滴度。13分析GENBANK數(shù)據(jù)庫的HBV基因突變情況在GENBANK數(shù)據(jù)庫中搜索中國(guó)地區(qū)報(bào)道的ACLF和CHBM相關(guān)的HBV全基因序列共258條ACLF患者序列143條，CHBM患者序列115條，分析其突變。2HBV突變與ACLF發(fā)病的關(guān)系的驗(yàn)證21樣本。來自80例無癥狀攜帶者ASYMPTOMATICCARRIERS，、152例CHBM、102例慢性重度乙型肝炎患者SEVERECHRONICHEPATITISB，CHBS和104例ACLF患者，共438例。22從200ΜL血清中提取HBVDNA，半巢式PCR擴(kuò)增HBV基因組目標(biāo)序列，PCR產(chǎn)物行常規(guī)SANGER測(cè)序。23檢測(cè)上述樣本肝功能指標(biāo)，HBV血清標(biāo)記物和HBVDNA滴度。結(jié)果1ILLUMINA高通量測(cè)序篩選結(jié)果11作為質(zhì)量控制的質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果顯示所測(cè)得的讀長(zhǎng)36BPDNA序列的不同位置發(fā)生測(cè)序錯(cuò)誤的頻率不一致，在20位堿基之后其堿基替換率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，當(dāng)位于序列的第3036個(gè)堿基時(shí)，測(cè)序的錯(cuò)誤率顯著上升。為了降低錯(cuò)配率，我們截取每個(gè)短片段序列前面的20BP進(jìn)行質(zhì)粒全長(zhǎng)的拼接。質(zhì)粒序列的總體誤差率為049％，其中每一百個(gè)核苷酸中錯(cuò)配堿基讀取頻率＞4％的核苷酸平均為24個(gè)，將4％作為區(qū)分真實(shí)突變和技術(shù)誤差的界線。12T216C、G285A、A1846T、G1896A、C1913AG、G2095A、A2159G、A2189C和G2345A為ACLF患者常見的突變位點(diǎn)，在12例ACLF患者中發(fā)生上述突變的病例數(shù)分別為10例、9例、10例、10例、8例、5例、10例、11例和7例。13T216C、G285A、A1846T、G1896A、C1913AG、G2095A、A2159G、A2189C和G2345A這9個(gè)位點(diǎn)的突變頻率在ACLF患者中顯著高于慢性輕度肝炎患者（P＜005或P＜001）。14基本核心啟動(dòng)子區(qū)BASALCEPROMOTER，BCPA1762TG1764A突變?cè)?2例ACLF和12例CHBM患者中的發(fā)生率均為6例。其突變頻率在ACLF患者和慢性輕度肝炎患者未見顯著差異。15從GENBANK數(shù)據(jù)庫下載258條HBV全基因序列，分析上述突變的分布情況發(fā)現(xiàn)T216C、G285A、A1846T、G1896A、C1913AG、A2159G、A2189C和G1764A在ACLF中的發(fā)生率均顯著高于CHBM，G2095A、G2345A和A1762T在ACLF組和CHBM組間未見差異。分別對(duì)HBVB基因型和C基因型患者的突變進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在B基因型的患者中，T216C、G285A、A1846T、G1896A和C1913AG這5個(gè)位點(diǎn)突變?cè)贏CLF組中顯著高于CHBM組C基因型患者中，A1846T、C1913AG、A2159G、A2189C和G1764A這5個(gè)突變?cè)贏CLF組中顯著高于CHBM組。A1762TG1764A雙聯(lián)突變?cè)贐基因型和C基因型的ACLF患者中均未見顯著升高。2HBV點(diǎn)突變與ACLF發(fā)病的關(guān)系的驗(yàn)證結(jié)果21ACLF組的B基因型比率顯著高于其余三組慢性乙型肝炎患者。22T216C、G285A、A1846TG、G1896A、C1913AG、A2159GC和A2189TC這7個(gè)突變的發(fā)生率在ACLF組顯著高于、CHBM和CHBS組（P＜005或P＜001）。23T216C、G285A、A1846TG、G1896A、C1913AG這5個(gè)位點(diǎn)在HBV基因型B的感染者中顯著高于HBV基因型C感染者。24對(duì)、CHBM、CHBS和ACLF患者的B基因型和C基因型毒株的突變進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)以S為對(duì)照組，B基因型毒株感染者中，T216C、G285A、G1896A、C1913AG突變?cè)贑HBS和ACLF組中均顯著升高C基因型毒株感染者中，A1846TG、G1896A、C1913AG、A2159GC突變?cè)贏CLF組和CHBS組中顯著升高。以CHBM為對(duì)照組，HBVB基因型毒株感染者中，T216C、G285A、G1896A、C1913AG和A2159GC在ACLF患者中顯著升高C基因型毒株感染者中，G285A、A1846TG、G1896A和C1913AG在ACLF患者中顯著升高。當(dāng)以CHBS為對(duì)照時(shí)，基因型B毒株感染者中，A2159GC和A2189TC在ACLF組中顯著升高。25與非ACLF組比較，B基因型毒株的T216C、G285A、A1846TG、G1896A、C1913AG、A2159GC和A2189TC與ACLF密切相關(guān)，而C基因型毒株的G285A、A1846TG、G1896A、C1913AG和A2159GC與ACLF密切相關(guān)。26多因素分析顯示T216C、G1896A、C1913AG和A2159GC是ACLF發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。27T216C、G1896A、C1913AG和A2159GC的兩個(gè)或以上的聯(lián)合突變與ACLF發(fā)生密切相關(guān)。28“含C216的聯(lián)合突變”，“含AG1913的聯(lián)合突變”，“含GC2159的聯(lián)合突變”對(duì)ACLF診斷具有較高的特異性。結(jié)論1B基因型病毒感染的慢性乙型肝炎患者更容易發(fā)展為ACLF。2T216C、G1896A、C1913AG和A2159GC突變?yōu)锳CLF發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。其中T216C和A2159GC系本研究新發(fā)現(xiàn)的ACLF發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素T216C位點(diǎn)已申請(qǐng)國(guó)際專利，國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CTCN2012071108，提示了HBVS區(qū)和核心區(qū)突變?cè)贏CLF發(fā)病過程中可能起著重要作用。3HBV聯(lián)合突變的分析發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合突變?cè)贏CLF發(fā)病中發(fā)揮更為重要的作用。“含C216的聯(lián)合突變”，“含AG1913的聯(lián)合突變”，“含GC2159的聯(lián)合突變”對(duì)ACLF的診斷特異性較高。4上述病毒突變可作為預(yù)測(cè)乙型肝炎加劇的分子標(biāo)志物，為阻止ACLF發(fā)病和改善HBV感染者的預(yù)后提供依據(jù)。

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簡(jiǎn)介：溫州醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文論文題目△∑壘曼主I鯉漁痘皇純疸痊痘垂絲角腿煎壓亟塹生魚笪笪趨廢硒塞答辯委員會(huì)主席揚(yáng)基主塾拯塑J匕省△民醫(yī)瞳2答辯委員會(huì)成員盒陋勇教援濕劃醫(yī)型太堂附屆8艮視光醫(yī)醫(yī)2王銦塾拯遏劃直蟲墜醫(yī)院2論文答辯日期2O15．5．28溫州醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文AVASTIN,FI療單純皰疹病毒性角膜炎所致新生血管的I臨床研究中文摘要1．目的評(píng)估局部應(yīng)用AVASTIN⑧治療單純皰疹病毒性角膜炎所致新生血管的療效及安全性。2．方法本研究采用前瞻性自身前后對(duì)照的研究方法。選取2013年6月至2014年2月在我院確診為單純皰疹病毒性角膜炎的患者共15例17眼。所有患者因單純皰疹病毒性角膜炎反復(fù)發(fā)作引起角膜新生血管，入組前均在我院門診經(jīng)過規(guī)范化抗病毒藥物阿昔洛韋分散片一次200MG一天5次及皮質(zhì)類固醇激素藥物妥布霉素地塞米松滴眼液一次1滴，一天4次；每周遞減1次，為期1個(gè)月治療后患者眼紅、眼痛癥狀緩解，但新生血管消退效果不佳。在此治療基礎(chǔ)上，停用激素類藥物，給予所有入組患者AVASTINO．5MG配在2ML含0．01％苯扎溴銨的生理鹽水溶液中滴患眼，一天3次，用藥期間均繼續(xù)常規(guī)阿昔洛韋分散片口服治療。分別于用藥后第1周、第2周、第3周，一直到第7周每周進(jìn)行隨訪。評(píng)估AVASTIN治療新生血管的療效。所有患者依次進(jìn)行如下檢查視力、裂隙燈顯微鏡檢查、裂隙燈數(shù)字角膜攝影，觀察新生血管各項(xiàng)指標(biāo)的變化，如新生血管面積、血管侵入面積等。視力及新生血管評(píng)估指標(biāo)用SPSSL9．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。3．結(jié)果本研究共納入15例17眼，其中男10只眼，女7只眼，年齡16’67歲，平均45．30±11．50歲，所有患者均嚴(yán)格遵醫(yī)囑用藥并堅(jiān)持門診隨訪。所有患者的主、客觀結(jié)果如下1所有患者用藥1周與用藥前、用藥5周與用藥4周相比，新生血管面積明顯減少PO．007，其他時(shí)間段組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2所有患者用藥1周與用藥前相比，眼部新生血管侵入面積變化均較前有所減少PO．007，其他時(shí)間段組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3所有患者用藥1周與用藥前相比，眼部新生血管數(shù)目有所減少，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0．007，其他時(shí)間段組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4患者用藥1周與用藥前、用藥2周與用藥1周相比，視力有所提高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0．007，其他時(shí)間段組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5本研究過程中15例17眼均接受7周的AVASTIN2

簡(jiǎn)介：點(diǎn)擊查看更多病毒性腦（膜）炎196例臨床及腦脊液特點(diǎn)回顧性分析.pdf精彩內(nèi)容。

簡(jiǎn)介：目的探討恩替卡韋治療慢性乙型肝炎（CHB）患者發(fā)生病毒學(xué)突破的相關(guān)危險(xiǎn)因素。方法收集263例CHB感染者使用恩替卡韋（ETV）治療患者的病歷資料，做回顧性調(diào)查并分析患者的生化、病毒學(xué)、用藥史、依從性等指標(biāo)是否影響病毒學(xué)突破的發(fā)生，并分析相關(guān)指標(biāo)與ETV病毒學(xué)突破的關(guān)聯(lián)。結(jié)果263例患者，經(jīng)過24個(gè)月的隨訪觀察，24例發(fā)生病毒學(xué)突破，突破發(fā)生率為913％。其中HBEAG陽性和陰性病毒學(xué)突破率分別為1118、538，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0118）；既往有LAM使用史和無LAM使用史病毒學(xué)突破發(fā)生率分別為1495，513，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0007）；ETV10MG、05MG病毒學(xué)突破率分別為741，932，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P1000）；有肝硬化和無肝硬化患者病毒學(xué)突破發(fā)生率分別為1563，704，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0038）；依從性差和依從性好的患者病毒學(xué)突破發(fā)生率分別為2941，611，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0000）；ETV初治時(shí)ALT低中高三個(gè)水平組病毒學(xué)突破發(fā)生率分別為1024，648，1429，三個(gè)水平組之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞005）；ETV初治時(shí)HBVDNA低中高水平組病毒學(xué)突破發(fā)生率分別為506、556、1842，低中水平組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞005），低、高水平組和中、高水平組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜005）。治療6個(gè)月時(shí)HBVDNA轉(zhuǎn)陰率越高，病毒學(xué)突破發(fā)生率越低。既往有拉米夫定（LAM）使用史的患者治療12個(gè)月時(shí)病毒學(xué)突破發(fā)生率為280，治療24個(gè)月時(shí)累積發(fā)生率為1495，發(fā)生病毒學(xué)突破的平均時(shí)間為（1988±476）個(gè)月；而初治時(shí)使用ETV在治療12個(gè)月時(shí)病毒學(xué)突破發(fā)生率為064，治療至24個(gè)月時(shí)發(fā)生率為513。結(jié)論既往有LAM使用史、ETV初治時(shí)HBVDNA＞107COPIESML、有肝硬化、依從性差是恩替卡韋發(fā)生病毒學(xué)突破的危險(xiǎn)因素；治療6個(gè)月時(shí)HBVDNA轉(zhuǎn)陰率越高，病毒學(xué)突破發(fā)生率越低；既往有LAM使用史的患者較ETV初治的患者病毒學(xué)突破發(fā)生率高。

簡(jiǎn)介：曲阜師范大學(xué)碩士學(xué)位論文樣例與問題聯(lián)結(jié)方式影響遷移和認(rèn)知負(fù)荷的實(shí)驗(yàn)研究姓名孫志軍申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)發(fā)展與教育心理學(xué)指導(dǎo)教師宋廣文20070401ABSTRACTWORKEDEXAMPLELEARNING，WHICHCATCHESTHEEYESOFLOTSOFRESEARCHERS，ISAHOTTOPICOFTRANSFERLEARNINGCOGNITIVELOADTHEORYINSISTSANICETEACHINGDESIGNSHOULDNOTONTYREDUCETHEEXTRANEOUSCOGNITIVETOADBUTENHANCETHEGERMANECOGNITIVELOADFORMERSTUDIESINSISTSTHATEXAMPLESCANREDUCETHEEXTRANEOUSCOGNITIVELOADENHANCETHEGERMANECOGNITIVELOADEXISTSTUDIESINSISTSTHATLEARNINGISIMPROVEDWHENWORKEDEXAMPLESAREPAIREDWITHPRACTICEPROBLEMSCOMPAREDTOWHENONLYWORKEDEXAMPLESAREPROVIDEDTOTHELEARNERSBUTTHEREAREFEWSTUDIESOFCONFORMITYDESIGNABOUTEXAMPLESANDPROBLEMSBASEDONTHEFORMERSTUDIES，THISSTUDYPUTFORWARDTWOKINDSOFCONNECTIONMODESABOUTEXAMPLESANDPROBLEMSEXAMPLEPROBLEMPAIRANDPROBLEMEXAMPLEPAIR，WHICHCOMPAREDTOPUREWORKEDEXAMPLESLEARNINGANDPUREPROBLEMSSOLVINGPRACTICEPRIORKNOWLEDGEOFSTUDENTSISANIMPORTANTVARIABLEINCOGNITIVELOADRESEARCHWHICHCALLINFLUENCETHEEFFECTSOFSPECIFICSTRATEGIESWHICHINCREASEGERMANECOGNITIVELOAD2X4X2MIXDESIGNWASAPPLIEDINTHISSLALDYWHICHEXAMINEDHOWPRIORKNOWLEDGEOFSTUDENTS，CONNECTIONMODESABOUTEXAMPLESANDPROBLEMSANDTRANSFERTYPESINFLUENCEDTHETRANSFERLEARNINGANDFURTHEROBSERVEDTHEINFLUENCETOCOGNITIVELOADOFPRIORKNOWLEDGEANDCONNECTIONMODESABOUTEXAMPLESANDPROBLEMSTHERESULTSHOWEDTHAT1PRIORKNOWLEDGEOFSTUDENTSHADSIGNIFICANTINFLUENCESONTRANSFERSCORESANDCOGNITIVELOADTRANSFERSCORESOFHIGLLPRIORKNOWLEDGESTUDENTSWEREBETTERTHANTHOSEOFLOWPRIORKNOWLEDGEGERMANECOGNITIVELOADOFSTUDENTSWITHHIGHPRIORKNOWLEDGEWASENHANCEDHIGHERTHANTHOSEOFLOWPRIORKNOWLEDGE2CONNECTIONMODESABOUTEXAMPLESANDPROBLERNSINFLUENCEDTRANSFERSCORESANDCOGNITIVELOADSIGNIFICANTLYTHESTUDENTSWITHLOWPRIORKNOWLEDGEIMPROVEDNEARTRANSFERUNDERTHEDESIGNOFPROBLEMEXAMPLEPA址ANDIMPROVEDFARTRANSFERUNDEREXAMPLEPROBLEMPAIRTHESTUDENTSWITHLOWPDORKNOWLEDGENOTONLYREDUCEDTHEEXLRANEOUSCOGNITIVELOADBUTALSOENHANCEDTHEGERMANE2

簡(jiǎn)介：目的過敏性紫癜又稱亨舒綜合征HENOCHSCHONLEINPURPURA，HSP，是一種以廣泛的白細(xì)胞破裂性小血管炎為主要病理改變的系統(tǒng)性血管炎。好發(fā)于學(xué)齡期兒童，男孩多于女孩。病因尚未完全明確，微生物感染、食物、藥物過敏是其常見誘因。病變可累及皮膚、關(guān)節(jié)、胃腸道、腎臟等臟器。常以皮膚紫癜為首發(fā)癥狀，少數(shù)患兒以腹痛、關(guān)節(jié)疼痛、腎臟損害為首發(fā)表現(xiàn)。紫癜性腎炎（HENOCHSCHONLEINPURPURANEPHRITIS，HSPN）是由過敏性紫癜引起的腎臟損傷，多出現(xiàn)在病程的6個(gè)月以內(nèi)，發(fā)病率為25％～80％，是兒童時(shí)期最常見的繼發(fā)性腎小球疾病，也是影響過敏性紫癜預(yù)后的決定性因素。正常兒童尿中通常含有的尿蛋白≤100MGM224H，尿沉渣紅細(xì)胞＜3個(gè)HP。當(dāng)HSP引起的免疫反應(yīng)導(dǎo)致腎臟受損后，腎小球基底膜GBM濾過孔徑增大、基底膜斷裂，濾過膜上帶負(fù)電荷的糖蛋白減少導(dǎo)致帶負(fù)電荷的血漿蛋白濾過量明顯增加，電荷屏障損傷，腎臟通透性增強(qiáng)，此時(shí)在臨床上形成蛋白尿24小時(shí)尿蛋白定量＞150MGD和（或）腎性血尿（尿沉渣紅細(xì)胞計(jì)數(shù)＞3個(gè)HP）。尿微量白蛋白（尿MALB）檢測(cè)可以更加靈敏的反應(yīng)早期腎損傷的發(fā)生1。MALB＞20MGL為異常。小兒常見的呼吸道病毒包括腺病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒（甲型、乙型）和副流感病毒。可以通過間接免疫熒光法檢測(cè)HSP患兒血清病毒IGM抗體，以了解病毒感染狀況。有研究表明，呼吸道病毒感染可能與過敏性紫癜發(fā)病有關(guān)2。但目前尚缺乏有關(guān)呼吸道病毒感染與過敏性紫癜患兒腎損傷的相關(guān)性報(bào)道。本文旨在通過檢測(cè)HSP患兒呼吸道病毒IGM抗體、尿蛋白定量、尿沉渣的動(dòng)態(tài)變化，以探討呼吸道病感染與過敏性紫癜腎損傷的相關(guān)性。方法1、研究對(duì)象選取2011年12月至2012年12月河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院兒內(nèi)科收入院的92例初治過敏性紫癜患兒為研究對(duì)象。過敏性紫癜的診斷依據(jù)典型的皮疹、伴或不伴胃腸道、關(guān)節(jié)、腎臟癥狀及血小板計(jì)數(shù)做出臨床診斷。紫癜性腎炎診斷依據(jù)在過敏性紫癜病程6個(gè)月內(nèi)，出現(xiàn)血尿和（或）蛋白尿。2、研究方法將入選的患兒治療前進(jìn)行4種常見呼吸道病毒檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，病毒陽性者列為觀察組（A組），病毒陰性者列為對(duì)照組（B組）。病毒陽性組給予利巴韋林注射液10～15MGKGD抗病毒治療7天。3個(gè)月后復(fù)查呼吸道病毒IGM抗體。檢測(cè)結(jié)果仍未陰轉(zhuǎn)者為病毒持續(xù)陽性組A1組，陰轉(zhuǎn)者為病毒陰轉(zhuǎn)組（A2組）。共隨訪6個(gè)月，觀察比較各組腎損傷的發(fā)生率，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。3、檢測(cè)方法31、呼吸道病毒檢測(cè)抽取2ML靜脈血送檢我院兒科門診血清呼吸道常見病原體IGM抗體檢測(cè)，采用間接免疫熒光法。檢測(cè)方法在載玻片的孔里分別加入稀釋的血清和質(zhì)控品，37℃溫育90分鐘PBS洗兩次，蒸餾水洗一次加入熒光素結(jié)合物，37℃溫育30分鐘PBS洗兩次，蒸餾水洗一次，自然晾干加入一小滴封閉介質(zhì)，蓋上蓋玻片在熒光顯微鏡400倍視野下觀察。32、尿蛋白定量留取24小時(shí)尿液，計(jì)算24小時(shí)尿液總量，充分混勻后取3ML送檢，采用鄰苯三酚紅比色測(cè)定法進(jìn)行定量檢測(cè)，收集檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。33、尿沉渣檢測(cè)取2小時(shí)內(nèi)晨起中段尿10ML送檢腎內(nèi)科尿沉渣實(shí)驗(yàn)室。檢測(cè)方法取尿液10ML以1500RMIN離心5MIN去上清液，留沉渣02ML輕搖離心管，混勻有形成分用1010鏡頭，觀察其中有形成分的全貌及管型用1040鏡頭觀察細(xì)胞成分和數(shù)量，連續(xù)觀察10個(gè)不同視野，取所見的最低和最高值，記錄結(jié)果。34、尿微量白蛋白檢測(cè)留取晨起清潔中段尿2ML送檢兒科實(shí)驗(yàn)室。檢測(cè)方法采用免疫熒光干式定量法對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)。試劑盒及IGHROMAREADER免疫熒光分析儀由韓國(guó)BODITECHMEDINC公司生產(chǎn)。4、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSSSTATISTICS130數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)資料數(shù)據(jù)進(jìn)行描述和統(tǒng)計(jì)分析。選取P＜005為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1、一般資料觀察組43人，其中男24人，女19人，男女比例126∶1，平均年齡833±286歲。對(duì)照組49人，其中男27人，女22人，男女比例123∶1，平均年齡853±277歲。兩組性別、年齡比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2、隨訪6個(gè)月，觀察組（A組）腎損傷的發(fā)生率為535％，對(duì)照組B組腎損傷的發(fā)生率為285％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明呼吸道病毒感染可以增加HSP患兒腎損傷的發(fā)生率。其中，病毒持續(xù)陽性組A1組腎損傷發(fā)生率為647％1117，病毒陰轉(zhuǎn)組A2組腎損傷發(fā)生率為46％1226，對(duì)照組（B組）腎損傷的發(fā)生率為285％，三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明病毒持續(xù)存在對(duì)腎臟損傷影響意義更大。3、不同病毒感染率依次為流感病毒2609％2492、副流感病毒1196％1192、腺病毒543％592、呼吸道合胞病毒326％392。4、不同病毒（腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒）腎損傷發(fā)生率分別為40％、5417％、0％、7273％，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。認(rèn)為呼吸道病毒感染可以導(dǎo)致腎損傷的發(fā)生，但與病毒的種類關(guān)系不大。結(jié)論1、過敏性紫癜合并呼吸道病毒感染時(shí)腎損傷的幾率增大，其可能的機(jī)制為感染的病毒在體內(nèi)作為抗原引起抗體的產(chǎn)生，抗原、抗體結(jié)合形成免疫復(fù)合物，沉積于腎臟造成了腎損傷。但HSP腎損傷與合并的病毒種類關(guān)系不大。尚不能證明某一種單一病毒是HSP腎損傷的發(fā)病因素。2、HSP患兒中流感病毒感染最高，認(rèn)為流感病毒在過敏性紫癜發(fā)病機(jī)制中占主要地位，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。3、病毒感染持續(xù)存在時(shí)作為抗原反復(fù)刺激機(jī)體，增加腎損傷的發(fā)生率。

簡(jiǎn)介：目的構(gòu)建丙型肝炎病毒HCV核心蛋白真核表達(dá)載體PIRESCE，轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的人源性肝細(xì)胞QSG7701，研究丙型肝炎病毒核心蛋白對(duì)QSG7701細(xì)胞凋亡及自噬的影響。初步探討丙型肝炎病毒核心蛋白在丙型肝炎和肝細(xì)胞癌中的致病機(jī)制。方法體外培養(yǎng)人源性肝細(xì)胞QSG7701，將細(xì)胞分為QSG7701組（未轉(zhuǎn)染組）、QSG7701PCDNA31組（轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組）及QSG7701CE組（轉(zhuǎn)染PIRESCE組）。然后通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將HCV核心蛋白真核表達(dá)載體PIRESCE轉(zhuǎn)染至QSG7701細(xì)胞中。ANNEXINVFITCPI雙染倒置熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核變化流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率WESTERNBLOTTING印記法檢測(cè)HCV核心蛋白及轉(zhuǎn)錄因子NFΚB的表達(dá)采用小分子干擾RNASIRNA技術(shù)抑制肝細(xì)胞NFΚB表達(dá)，流式細(xì)胞儀再次檢測(cè)三組細(xì)胞凋亡率。WESTERNBLOTTING印記法檢測(cè)自噬體標(biāo)記分子LC3及自噬相關(guān)基因BECLIN1的表達(dá)。結(jié)果ANNEXINVFITCPI雙染法倒置熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核變化，可見PI將凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核染成紅色，細(xì)胞核大小不等，出現(xiàn)核固縮、核碎裂、核溶解等細(xì)胞凋亡的特異性表現(xiàn)流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示QSG7701CE組細(xì)胞凋亡率為（134±007）％，低于QSG7701組（未轉(zhuǎn)染組）（235±011）％和QSG7701PCDNA31組（轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組）（258±013）％，三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜005）WESTERNBLOTTING印記法檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子NFΚB在QSG7701CE組表達(dá)上調(diào)將QSG7701細(xì)胞分為正常對(duì)照組（不作處理）、陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染陰性SIRNA組）及SIRNA組（轉(zhuǎn)染NFΚBSIRNA組），小分子干擾RNASIRNA技術(shù)抑制肝細(xì)胞NFΚB表達(dá)，流式細(xì)胞儀再次觀察凋亡率，SIRNA組凋亡率為（238±017）％，高于正常對(duì)照組120±011％和陰性對(duì)照組（129±009）％，三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜005）。WESTERNBLOTTING法檢測(cè)自噬泡標(biāo)記分子LC3及自噬相關(guān)基因BECLIN1在QSG7701CE組表達(dá)上調(diào)。結(jié)論HCV核心蛋白能夠抑制人源性肝細(xì)胞QSG7701的細(xì)胞凋亡，其主要機(jī)制可能是轉(zhuǎn)錄因子NFΚB表達(dá)上調(diào)。HCV核心蛋白可提高QSG7701的細(xì)胞自噬水平，其主要機(jī)制可能是自噬相關(guān)基因BECLIN1表達(dá)上調(diào)。

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簡(jiǎn)介：肝臟疾病嚴(yán)重威脅人類健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年約有140萬人死于由肝炎、感染、腫瘤等慢性肝臟疾病引起的晚期終末肝功能衰竭。原位肝移植（THOTOPICLIVERTRANSPLANTATION，OLT）是目前治療肝衰竭最主要的治療手段，但由于肝源短缺，費(fèi)用高昂等問題，使得肝移植惠及的人群非常有限，難以廣泛開展。近年來，生物人工肝BIOARTIFICIALLIVER，BAL和肝細(xì)胞移植LIVERCELLTRANSPLANTATION，LCT開始作為肝移植的輔助或替代療法而日益受到人們的關(guān)注。然而，細(xì)胞來源不足一直是兩者發(fā)展及應(yīng)用的一大瓶頸。20世紀(jì)90年代以來興起的干細(xì)胞技術(shù)日漸成熟，成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。以干細(xì)胞移植為主的細(xì)胞療法作為一種新興的手段，為解決種子細(xì)胞來源和肝臟疾病的治療提供了新的思路和方法。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BONEMARROWMESENCHYMALSTEMCELLS，BMSCS）是一類具有自我復(fù)制功能和分化潛能的早期未分化細(xì)胞，屬于成體干細(xì)胞的一種，具有很強(qiáng)的可塑性，可以跨越胚層橫向分化為肝樣細(xì)胞等多種組織細(xì)胞，且具備取材方便、體外培養(yǎng)技術(shù)成熟以及自體移植等優(yōu)點(diǎn)，因此其有望成為組織工程和細(xì)胞治療的理想種子細(xì)胞。如何高效誘導(dǎo)BMSCS向肝樣細(xì)胞分化，是干細(xì)胞移植等肝病治療的關(guān)鍵，但由于其具體的分化機(jī)制尚未明確，這一關(guān)鍵問題尚未得到滿意解決，臨床應(yīng)用也遠(yuǎn)未達(dá)到預(yù)期效果。因此探究BMSCS向肝樣細(xì)胞分化的分子機(jī)制意義重大。BMSCS向肝樣細(xì)胞分化的事實(shí)已經(jīng)得到了多數(shù)實(shí)驗(yàn)的證實(shí)，但其具體的分化機(jī)制尚存在爭(zhēng)議。目前主要觀點(diǎn)有①橫向分化學(xué)說BMSCS本身具有多向分化潛能，可以分化為肝樣細(xì)胞②細(xì)胞融合學(xué)說BMSCS首先與宿主肝細(xì)胞融合，然后進(jìn)一步分化為肝樣細(xì)胞。由于許多干細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)并未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞融合的現(xiàn)象，故目前多數(shù)學(xué)者更支持橫向分化學(xué)說，然而BMSCS橫向分化的具體調(diào)控機(jī)制仍不清楚。由于微環(huán)境是干細(xì)胞賴以生存的“土壤”，因此眾多研究人員將其作為干細(xì)胞定向分化機(jī)制研究的切入點(diǎn)。細(xì)胞局部的微環(huán)境包括細(xì)胞周圍多種細(xì)胞因子、激素、基質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)等。細(xì)胞因子的作用尤為重要，在不同的細(xì)胞因子作用下BMSCS可分化為不同的細(xì)胞類型。微環(huán)境中的各種因子的表現(xiàn)類型、濃度和作用次序是影響B(tài)MSCS分化的重要因素。不同時(shí)期、不同部位、不同狀態(tài)下微環(huán)境的組成及結(jié)構(gòu)不同，對(duì)干細(xì)胞的影響也不同。正常情況下，微環(huán)境保護(hù)干細(xì)胞不被清除，維持干細(xì)胞的未分化狀態(tài)，同時(shí)抑制其過度增殖當(dāng)機(jī)體受到損害時(shí)，微環(huán)境發(fā)生相應(yīng)改變，通過一定的信號(hào)通路傳遞，有選擇地激活或抑制相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，啟動(dòng)相關(guān)基因，從而出現(xiàn)特定的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)控，進(jìn)而使干細(xì)胞向特定成體細(xì)胞分化?；谝陨嫌^點(diǎn)，我們提出肝衰竭的肝內(nèi)微環(huán)境中存在著某些有別于生理狀態(tài)下的生物因子，這些因子能夠刺激BMSCS向肝樣細(xì)胞分化。為了探尋究竟是何種生物因子在發(fā)揮誘導(dǎo)作用，我們課題組在前期利用蛋白組學(xué)技術(shù)對(duì)比肝衰竭大鼠和健康大鼠肝臟，篩選出27個(gè)有顯著差異的蛋白位點(diǎn)，通過生物信息學(xué)分析我們發(fā)現(xiàn)其中的酪蛋白激酶I?。ㄉ险{(diào)）、T盒轉(zhuǎn)錄因子（上調(diào)）和酪氨酸蛋白激酶（下調(diào)）與細(xì)胞的增殖、分化密切相關(guān)。酪蛋白激酶IΑCASEINKINASEIΑ，CKIΑ是一類具有獨(dú)特理化特性的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，廣泛存在于真核生物中，且分布廣泛，主要分布在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜等部位。具有組成型活力（即被分離或者原核表達(dá)的CKIΑ都具有活性）。CKIΑ可磷酸化底物蛋白質(zhì)中已被磷酸化的位點(diǎn)，也可作為其它蛋白激酶的底物被磷酸化，參與蛋白質(zhì)的級(jí)聯(lián)磷酸化過程，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用，進(jìn)而參與包括基因表達(dá)、細(xì)胞增殖及分化等多種細(xì)胞調(diào)節(jié)過程。研究已經(jīng)證實(shí)CKIΑ主要參與WNT和HH信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，而該兩條信號(hào)通路與干細(xì)胞的分化和增殖密切相關(guān)。肝衰竭微環(huán)境中CKIΑ明顯上調(diào)，這些CKIΑ來自于何處是受損的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的，還是微環(huán)境的變化刺激干細(xì)胞分泌的尚不清楚。而上調(diào)的CKIΑ能促進(jìn)BMSC肝樣分化是外源性的CKIΑ直接刺激BMSCS，還是微環(huán)境中某些因素誘導(dǎo)BMSCS自身過表達(dá)CKIΑ，繼而這些內(nèi)源性表達(dá)的CKIΑ促進(jìn)BMSCS分化呢這些問題也是我們課題組一直欲研究探討的。因此，本研究中的第一部分?jǐn)M采用分子生物學(xué)技術(shù)，利用原核表達(dá)體系從大腸桿菌中表達(dá)出重組CKIΑ，并擬用NI柱親和層析使其得以高效純化，為下一步我們進(jìn)行CKIΑ與BMSCS共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究做前期準(zhǔn)備，也為我們進(jìn)一步探討CKIΑ的生物學(xué)功能和研究它在BMSCS向肝樣細(xì)胞分化過程中的作用奠定基礎(chǔ)。本研究的第二部分我們擬通過GATEWAY技術(shù)構(gòu)建可誘導(dǎo)表達(dá)CKIΑ基因的慢病毒載體，再通過轉(zhuǎn)染大鼠BMSCS，獲得CKIΑ過表達(dá)的BMSCS模型，從而為下一步可誘導(dǎo)表達(dá)CKIΑ的鼠BMSCS肝向分化的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。第一章大鼠CKIΑ的原核表達(dá)及純化目的構(gòu)建大鼠CKIΑ表達(dá)質(zhì)粒，采用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)制備重組CKIΑ并將其純化，獲得濃度高、純度好的重組CKIΑ。方法RNA提取試劑盒分離、純化大鼠肝細(xì)胞總RNA。然后再以RNA為模板，以隨機(jī)六聚體核苷酸為引物，在MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下進(jìn)行反應(yīng)，合成CDNA的第一鏈。根據(jù)GENBANK報(bào)道的大鼠CKIΑ的編碼序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增大鼠CKIΑ基因的兩對(duì)引物，分別在內(nèi)側(cè)上下游引物5端加上限制性酶切位點(diǎn)NDEI和BAMHI。以RT反應(yīng)產(chǎn)物CDNA為模板，用TAQDNA聚合酶進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增CKIΑ基因。用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳分離純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物后，將其插入原核表達(dá)質(zhì)粒PET16B，構(gòu)建重組質(zhì)粒PET16BCKIΑ，經(jīng)酶切和DNA測(cè)序鑒定后，將PET16BCKIΑ轉(zhuǎn)化大腸桿菌STB13感受態(tài)細(xì)菌。再將工程菌以1∶100接種于含有葡萄糖和甘油的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD值約0510，之后繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)。4℃離心收集細(xì)菌，洗滌，超聲破碎。1200RMIN離心洗滌，分離包涵體。沉淀用含05％的TRITON洗滌3次，純化包涵體。用8M尿素溶解包涵體，然后用凝膠過濾純化目的蛋白，并用WESTERNBLOTTING對(duì)重組CKIΑ樣品進(jìn)行分析鑒定。結(jié)果1、經(jīng)核苷酸序列測(cè)定和NDEIBAMHI雙酶切鑒定結(jié)果表明，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒PET16BCKIΑ2、經(jīng)NINTA柱親和純化后的重組CKIΑ經(jīng)WESTERNBLOTTING檢測(cè)，在30KDA和40KDA之間可見明顯增濃的大小約為38KDA的蛋白條帶，并在膠片上有相應(yīng)的曝光條帶，與預(yù)期大小相符。結(jié)論1、成功構(gòu)建了PET16BCKIΑ原核表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌后表達(dá)出CKIΑ的重組蛋白2、初步摸索優(yōu)化了重組大鼠CKIΑ的表達(dá)條件，包含體提取步驟，初步純化工藝3、成功克隆了大鼠CKIΑ基因，序列分析和文獻(xiàn)報(bào)道一致4、純化獲得重組CKIΑ，為進(jìn)一步蛋白質(zhì)生物學(xué)功能鑒定和探討其在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的肝向分化中的作用研究奠定了一定基礎(chǔ)。第二章攜帶大鼠CKIΑ基因慢病毒載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染鼠BMSCS的實(shí)驗(yàn)研究目的構(gòu)建可誘導(dǎo)表達(dá)CKIΑ基因的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染人胚胎腎上皮細(xì)胞系293FT細(xì)胞獲得相應(yīng)的病毒顆粒，感染并獲得在強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)條件下穩(wěn)定、高效表達(dá)CKIΑ的BMSCS，為下一步可誘導(dǎo)表達(dá)CKIΑ的鼠BMSCS肝向分化的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。方法以PCDNACKIΑ為模板，采用聚合酶鏈反應(yīng)法擴(kuò)增前后端帶有ATTB重組位點(diǎn)的CKIΑ全長(zhǎng)序列。利用GATEWAY載體構(gòu)建技術(shù)，將擴(kuò)增產(chǎn)物通過BP反應(yīng)克隆至PDOWN載體中，測(cè)序正確后，采用LR重組酶將PDOWNCKIΑ，PUPEF1A和PLVDES3DPNEO進(jìn)行重組反應(yīng)，構(gòu)建慢病毒載體表達(dá)質(zhì)粒PLVDES3DPNEOEF1ACKIΑIRESEGFP。然后將PLVDES3DPNEOEF1ACKIΑIRESEGFP與包裝質(zhì)粒（PLVHELPERSL3、PLVHELPERSLA、PLVHELPERSL5）混合，利用脂質(zhì)體共同轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，包裝攜帶CKIΑ基因的慢病毒顆粒，然后感染大鼠BMSCS。在強(qiáng)力霉素DOXCYCLINE的誘導(dǎo)下，應(yīng)用RTPCR方法檢測(cè)感染BMSCSCKIΑ基因表達(dá)情況，應(yīng)用WESTERNBLOTTING方法檢測(cè)感染BMSCSCKIΑ的表達(dá)情況。結(jié)果通過酶切、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及測(cè)序驗(yàn)證可誘導(dǎo)CKIΑ真核表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建成功PLVDES3DPNEOEF1ACKIΑIRESEGFP與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293FT細(xì)胞，成功獲得攜帶CKIΑ基因的慢病毒顆粒，包裝產(chǎn)生病毒滴度為CKIΑ組5107TUML，繼之感染大鼠BMSCS，在強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)條件下，經(jīng)過熒光顯微鏡檢測(cè)感染率達(dá)90％以上，應(yīng)用RTPCR方法檢測(cè)重組CKIΑ基因表達(dá)情況，證實(shí)轉(zhuǎn)染組基因水平的表達(dá)量為陽性，未轉(zhuǎn)染組為陰性。應(yīng)用WESTERNBLOTTING方法檢測(cè)CKIΑ表達(dá)情況，證實(shí)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞表達(dá)陽性未轉(zhuǎn)染組表達(dá)為陰性。結(jié)論成功構(gòu)建出可誘導(dǎo)表達(dá)CKIΑ基因的慢病毒載體，獲得濃縮LENTIVIRALCKIΑ病毒液，在此基礎(chǔ)上最終獲得可以在強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)條件下CKIΑ過表達(dá)的BMSCS模型，為下一步可誘導(dǎo)表達(dá)CKIΑ的鼠BMSCS肝向分化的體內(nèi)外研究奠定基礎(chǔ)。

簡(jiǎn)介：分類號(hào)學(xué)校代碼10542密級(jí)學(xué)號(hào)201302080640ACOGNITIVESTUDYOFTHECOOCCURRENTINTERROGATIVECONSTRUCTION“V腳PREDICATE，，同現(xiàn)疑問詞構(gòu)式“VXXPREDICATE“的認(rèn)知研究指導(dǎo)教師姓名、職稱廑憝墜熬撞湖南師范大學(xué)學(xué)位評(píng)定委員會(huì)辦公室二。一六年六月ABSTRACTTHENONINTERROGATIVEUSAGESOFTHEINTERROGATIVEWORDSAREVERYIMPORTANTPARTSOFTHESTUDYOFINTERROGATIVESSOFARTHESTUDIESABOUTINTERROGATIVEWORDSMAINLYFOCUSONTHECLASSIFICATIONOFTHENONINTERROGATIVEUSAGESOFSINGLEINTERROGATIVEWORDSTHESTUDIESOFCOOCCURRENTINTERROGATIVEWORDSDON’TGETMUCHATTENTIONFROMMOSTOFTHESCHOLARS。碭HSTHISTHESISTAKESTHECOOCCURRENTCONSTRUCTION“VOPREDICATE“，WHICHISASPECIALFORMOFTHESAMEINTERROGATIVESWITHSEPARATEDUSAGE，ASTHESTUDYOBJECTBYANALYZINGTHESYNTACTICSTRUCTUREANDSEMANTICFEATURESUNDERTHEGUIDEOFPROTOTYPETHEORYANDCONSTRUCTIONGRAMMARTHETHESISHASMADEATENTATIVESTUDYABOUTTHEMOTIVATIONOFTHEEMERGENCEOFTHENONINTERROGATIVEMEANINGMEANWHILETHETHESISALSODISCUSSESTHECORRESPONDINGENGLISHEXPRESSIONSTOMAKEACONTRASTGENERALLYTHECOOCCURRENTINTERROGATIVEWORDSCANBECLASSIFIEDINTOFOURTYPES，NAMELYTHESAMEINTERROGATIVESWITHSUCCESSIVEUSAGE，THESAMEINTERROGATIVESWITHSEPARATEDUSAGE，THEDIFFERENTINTERROGATIVESWITHSUCCESSIVEUSAGEANDTHEDIFFERENTINTERROGATIVESWITHSEPARATEDUSAGETHEOBJECTOFTHISTHESIS‘‘VXXPREDICATE’’ISASPECIALFORMOFTHESAMEINTERROGATIVESWITHSEPARATEDUSAGEBASEDONTHELINGUISTICDATACOLLECTED，THETHESISANALYZESTHESIXSUBCONSTRUCTIONSOF“VXXPREDICATE’’IN

簡(jiǎn)介：目的（1）在HSV1感染BV2細(xì)胞建立的單純皰疹病毒性腦炎模型中，觀察TLR2信號(hào)通路各分子及下游炎性因子的變化，進(jìn)一步明確TLR2通路在其發(fā)病過程中的作用；2研究在正常BV2細(xì)胞、單純皰疹病毒性腦炎模型中，柯里拉京對(duì)TLR2信號(hào)通路、下游炎性因子的干預(yù)作用，探索柯里拉京發(fā)揮抗炎作用的機(jī)制。方法（1）培養(yǎng)BV2細(xì)胞系、VERO細(xì)胞系，用VERO細(xì)胞擴(kuò)增HSV1，提取HSV1，10稀釋病毒共8個(gè)滴度梯度，對(duì)BV2細(xì)胞進(jìn)行滴定，記錄細(xì)胞形態(tài)變化，采用REEDMUENCH法計(jì)算出病毒TCID50滴度，以100TCID滴度HSV1感染BV2細(xì)胞系建立單純皰疹病毒性腦炎模型，模型組、正常對(duì)照組分別用ELISA方法檢測(cè)炎癥因子TNFΑ、IL6的表達(dá)量，用RTPCR方法檢測(cè)TLR2及下游信號(hào)通路中TIRAP、MYD88、IRF5、P38、NEMOMRNA相對(duì)表達(dá)水平，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面TLR2的表達(dá)水平，用WESTERNBLOT方法檢測(cè)TIRAP、MYD88、P38、PP38、NEMO蛋白相對(duì)表達(dá)水平。（2）配制柯里拉京溶液，2倍稀釋8個(gè)濃度梯度對(duì)BV2細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，用MTT方法檢測(cè)細(xì)胞活性以觀察柯里拉京的細(xì)胞毒性。用柯里拉京分別干預(yù)正常BV2細(xì)胞、HSE模型細(xì)胞，用上述方法檢測(cè)TLR2及下游各分子的變化。結(jié)果（1）HSV1感染小膠質(zhì)細(xì)胞BV2造模成功，單純皰疹病毒性腦炎模型組相對(duì)于對(duì)照組TLR2信號(hào)通路下游炎性因子TNFΑ、IL6分泌明顯增多，TLR2及下游信號(hào)通路中TRIAP、MYD88、IRF5、P38、NEMO的MRNA表達(dá)量升高，細(xì)胞表面TLR2增多，TRIAP、MYD88、P38、PP38、NEMO蛋白表達(dá)水平增高；差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P結(jié)論（1）TLR2信號(hào)通路在單純皰疹病毒性腦炎發(fā)病過程中中介導(dǎo)強(qiáng)烈免疫反應(yīng)；（2）柯里拉京可能通過抑制TLR2信號(hào)通路的活性而減輕單純皰疹病毒性腦炎模型中的炎癥反應(yīng)。

簡(jiǎn)介：點(diǎn)擊查看更多上海市社區(qū)醫(yī)生及基地學(xué)員三階梯鎮(zhèn)痛認(rèn)知現(xiàn)況調(diào)查.pdf精彩內(nèi)容。