簡介：近些年來用基因工程技術(shù)克隆表達(dá)甲型流感病毒表面抗原HA和NA進(jìn)行患者血清抗體檢測是診斷疾病的重要手段。國內(nèi)外對流感病毒表面抗原血凝素HA、神經(jīng)氨酸酶NA的表達(dá)進(jìn)行了不少研究但仍存在不少的問題。如對表達(dá)系統(tǒng)的選擇如何增加表達(dá)量及表達(dá)后選擇何種純化方式才有利于提高表達(dá)蛋白的濃度和純度等。國內(nèi)外用于流感病毒表面抗原表達(dá)系統(tǒng)主要包括真核表達(dá)體系、無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)及原核表達(dá)體系。真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白易純化、活性不受影響但表達(dá)量低、成本高且細(xì)胞不易于培養(yǎng)無細(xì)胞表達(dá)研究技術(shù)還不夠成熟很難推廣應(yīng)用原核表達(dá)體系的表達(dá)量高操作方便省時常常可用于大量表達(dá)表達(dá)產(chǎn)物存在于包涵體為不溶性顆?？赏ㄟ^沉淀進(jìn)行純化為國內(nèi)主要應(yīng)用的蛋白表達(dá)系統(tǒng)。但原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)全長基因蛋白出現(xiàn)表達(dá)量低、純度低免疫活性弱等不足。研究發(fā)現(xiàn)原核表達(dá)系統(tǒng)中蛋白的分子結(jié)構(gòu)及其特性是影響蛋白表達(dá)的重要因素表達(dá)的蛋白為跨膜蛋白時蛋白的跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)為疏水性影響蛋白表達(dá)量、純度、免疫活性。此外基因信號肽序列干擾原核表達(dá)系統(tǒng)的識別影響表達(dá)效果。研究目的本研究包括甲型H1N1流感病毒HA1和NAE的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用研究兩個部分。由于甲型H1N1流感病毒HA和NA均為跨膜蛋白不利于蛋白的表達(dá)及純化。我們前期研究發(fā)現(xiàn)其全長基因表達(dá)的蛋白量低、免疫活性差。因此本研究的第一部分是在前期研究基礎(chǔ)上對已克隆測序的甲型H1N1流感病毒HA和NA全長基因進(jìn)行改造去除其信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)研究HA1和NAE基因在原核表達(dá)體系中蛋白表達(dá)量及其純化后的免疫活性。由于檢測患者血清抗體是診斷甲流的重要手段因此本研究第二部分進(jìn)一步研究改造后的HA1重鏈蛋白及NAE單體亞基蛋白在檢測患者血清抗體的作用探討其臨床應(yīng)用價值。研究方法第一部分在我們前期研究的廣東省2009年首株甲型H1N1流感病毒的HA和NA全長基因克隆基礎(chǔ)上通過PCR引物設(shè)計及擴(kuò)增去除血凝素和神經(jīng)氨酸酶的信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)獲得重要抗原HA1、NAE基因克隆到原核表達(dá)載體PET32A并轉(zhuǎn)化感受態(tài)TOP10大腸桿菌菌落PCR后挑取陽性單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)提取純化重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、質(zhì)粒酶切和測序鑒定后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21DE3細(xì)胞異丙基ΒD硫代半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)并用SDSPAGE研究蛋白表達(dá)效率IDAHISBIND樹脂純化表達(dá)蛋白WESTERNBLOT對蛋白免疫活性進(jìn)行檢測。第二部分應(yīng)用WESTERNBLOT檢測技術(shù)比較純化前后重組融合蛋白的免疫特性并檢測34例臨床血清標(biāo)本中甲流IGG和IGM抗體其中IGM抗體檢測結(jié)果與酶聯(lián)免疫吸附法抗流感病毒A型抗體IGM檢測結(jié)果進(jìn)行比較分析。研究結(jié)果第一部分1電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在約1000BP及1300BP處顯示明顯的條帶分別與預(yù)期的HA1、NAE基因片段大小相符2PCR、質(zhì)粒雙酶切和測序鑒定證實重組質(zhì)粒PET32AHA1、PET32ANAE構(gòu)建成功3SDSPAGE電泳顯示表達(dá)產(chǎn)物在分子量約68KD及72KD處可見明顯誘導(dǎo)蛋白條帶其分子量大小與預(yù)期融合表達(dá)蛋白分子量大小相符無IPTG誘導(dǎo)組未見蛋白條帶4表達(dá)蛋白用IDAHISBIND樹脂試劑盒純化后獲得了高濃度和高純度的HA168KD及NAE72KD重組蛋白5WESTERNBLOT檢測證實在重組蛋白與甲流病人血清結(jié)合的PVDF膜上可見明顯化學(xué)發(fā)光條帶而正常人檢測無發(fā)光條帶顯示表明表達(dá)蛋白具有較好的抗原活性。第二部分1在WESTERNBLOT檢測中純化前后的重組蛋白均可與甲流患者血清的抗體結(jié)合產(chǎn)生明顯的特異性免疫反應(yīng)條帶234例臨床標(biāo)本中表達(dá)蛋白檢測顯示IGG抗體陽性28例陰性6例IGM抗體陽性1例陰性33例3抗流感病毒A型抗體IGM檢測試劑盒檢測顯示IGM抗體可疑陽性1例陰性33例。結(jié)論甲型H1N1流感病毒HA和NA基因去除了信號肽和疏水區(qū)后可在原核表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)成功表達(dá)的甲型H1N1流感病毒重要抗原HA1、NAE蛋白具有免疫活性可用于WESTERNBLOT技術(shù)檢測甲流IGG、IGM抗體。

簡介：流行性感冒簡稱流感是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病能引起心肌炎、肺炎、支氣管炎等多種并發(fā)癥。接種疫苗是預(yù)防流感最有效的手段流感疫苗以雞胚為生產(chǎn)基質(zhì)有很多弊端例如難于在短時間內(nèi)提供足夠的雞胚進(jìn)行流感疫苗生產(chǎn)以應(yīng)對流感爆發(fā)的需求。而以哺乳動物細(xì)胞為生產(chǎn)基質(zhì)具有很大的優(yōu)勢可采用發(fā)酵罐進(jìn)行大規(guī)模的生產(chǎn)易于質(zhì)量控制。VERO細(xì)胞是WHO推薦用于人用疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞基質(zhì)能夠利用生物反應(yīng)器進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)在流感疫苗生產(chǎn)上有著廣闊的應(yīng)用前景。然而在VERO細(xì)胞培養(yǎng)流感病毒的過程中因此需要在培養(yǎng)液中添加胰酶常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)時殘留的血清會導(dǎo)致胰酶失活。采用無血清培養(yǎng)細(xì)胞可克服所含血清成分對病毒培養(yǎng)的干擾還可消除培養(yǎng)時潛在污染源并利于分離純化。微載體培養(yǎng)細(xì)胞提高了細(xì)胞和病毒的產(chǎn)量使大規(guī)模培養(yǎng)成為了可能。本實驗采用傳統(tǒng)的流感病毒重配方法獲得含有疫苗株的表面抗原HA和NA基因且在VERO細(xì)胞上高產(chǎn)的毒株在VERO細(xì)胞上連續(xù)傳30代觀察其傳代穩(wěn)定性并進(jìn)行無血清微載體培養(yǎng)為今后進(jìn)行細(xì)胞流感疫苗打下基礎(chǔ)。本課題研究包括以下兩部分內(nèi)容一、重配制備甲型流感病毒H1N1VERO細(xì)胞高產(chǎn)株及傳代穩(wěn)定性以流感病毒VERO細(xì)胞高產(chǎn)株AYUNNAN12005VAH3N2為母本株與WHO推薦的2007～2008年疫苗株ASOLOMONISLS32006H1N1共同感染VERO細(xì)胞用抗AYUNNAN12005VAH3N2血清篩選重配病毒并經(jīng)蝕斑純化獲得ASOLOMNISLS32006VAH1N1。在VERO細(xì)胞上連續(xù)傳10代建立工作種子批通過基因測序血凝抑制試驗免疫熒光試驗單向免疫瓊脂擴(kuò)散實驗證明重配病毒含有ASOLOMONISLS32006毒株表面抗原HA和NA的基因。在VERO細(xì)胞上連續(xù)傳代至30代分別收獲5代10代15代20代25代和30代的病毒采用RTPCR法擴(kuò)增出重配流感病毒的HA和NA基因片段并測序通過BIOEDIT軟件進(jìn)行基因序列比對分析其HA和NA片段與ASOLOMONISLS32006H1N1同源性達(dá)到了100％。重配獲得的流感病毒H1N1VERO細(xì)胞高產(chǎn)株即為ASOLOMONISLS32006VAH1N1能夠在VERO細(xì)胞上高產(chǎn)且連續(xù)傳代穩(wěn)定性良好。二、無血清微載體培養(yǎng)甲型流感病毒條件的優(yōu)化首先采用不同的細(xì)胞接種量在無血清微載體中片培養(yǎng)VERO細(xì)胞選擇適宜的細(xì)胞濃度。之后檢測不同PH值TPCK胰酶含量不同病毒接種量補加TPCK胰酶以及不同收毒時間和收毒體積對血凝效價的影響。確定適宜的細(xì)胞接種濃度后獲得優(yōu)化的無血清微載體培養(yǎng)甲型流感病毒條件病毒培養(yǎng)液PH值為72～74范圍內(nèi)TPCK胰酶含量為10ΜGML接種后48H補加胰酶病毒接種量MOI10并在72H一并收獲全部培養(yǎng)體積的病毒液VERO細(xì)胞最高血凝效價達(dá)到1024。篩選出無血清微載體培養(yǎng)VERO細(xì)胞接種流感病毒ASOLOMONISLS32006VAH1N1VERO細(xì)胞高產(chǎn)株的適宜條件為今后細(xì)胞流感疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

簡介：我國艾滋病免費抗病毒治療開始于2003年，其覆蓋率到2011年9月底達(dá)到735％。隨著抗病毒治療時間的延長，HIV1感染者中抗病毒治療失敗的情況不斷出現(xiàn)，耐藥性毒株成為治療失敗的主要原因。我國艾滋病的抗病毒治療具有鮮明的特點，一是我國流行的HIV1毒株以CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC及B亞型為主，與歐美等國以B亞型為主的情況顯著不同二是使用的抗病毒藥物為國產(chǎn)仿制藥三是采取鄉(xiāng)鎮(zhèn)醫(yī)療和疾控機構(gòu)統(tǒng)一發(fā)藥及管理病人的治療模式。這些特點使得我國HIV1毒株的耐藥性具有自己的特點和規(guī)律。我國已經(jīng)開展了HIV1耐藥毒株的流行病學(xué)監(jiān)測，獲得了耐藥毒株的流行率、影響因素、對抗病毒治療的影響等一系列重要的數(shù)據(jù)。在抗病毒治療發(fā)展的過程中，不斷有突變被新鑒定為耐藥突變，新突變對HIV1耐藥的影響、突變模式、突變之間的相互作用以及新突變對HIV1毒株的復(fù)制能力的影響還沒有深入的研究。本課題首先對部分地區(qū)HIV1感染者的基線耐藥和HIV1抗病毒治療失敗后的耐藥情況進(jìn)行了分子流行病學(xué)研究。隨后對與抗病毒治療相關(guān)的突變及突變組合構(gòu)建了質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后利用重組病毒對我國常用抗病毒治療藥物進(jìn)行了耐藥表型檢測，并使用合適的方法分析了單一位點的作用和不同位點之間可能存在的相互作用。最后對攜帶相關(guān)突變組合的病毒株的復(fù)制能力進(jìn)行了研究。綜合全部研究結(jié)果，旨在掌握我國HIV1耐藥毒株流行情況、闡明突變之間的相互作用及攜帶耐藥突變病毒的生物學(xué)特征，為臨床深入認(rèn)識HIV1耐藥機理及耐藥病人的科學(xué)管理提供理論依據(jù)、為確保我國抗病毒治療效果提供實際指導(dǎo)。第一部分我國部分地區(qū)HIV1基因型耐藥的橫斷面研究目前，耐藥HIV1毒株在我國各地廣泛出現(xiàn)和流行，掌握耐藥毒株流行狀況是臨床有效治療病人的基礎(chǔ)。本部分研究旨在了解我國HIV1耐藥毒株的分子流行病學(xué)特征，為進(jìn)一步研究和臨床抗病毒治療提供指導(dǎo)。我們收集2009年全國范圍內(nèi)8個省市的304例從未接受抗病毒治療的艾滋病患者的血漿標(biāo)本和2010年河南和河北兩省476例一線抗病毒治療失敗的艾滋病患者的血漿標(biāo)本，采用HIV1基因型耐藥檢測方法進(jìn)行了基因型耐藥檢測，擴(kuò)增目的基因片段長20KB，包含HIV1蛋白酶的99個氨基酸和逆轉(zhuǎn)錄酶的560個氨基酸，計算耐藥毒株流行率并分析耐藥相關(guān)的因素。結(jié)果12010年河南省和河北省抗病毒治療失敗標(biāo)本擴(kuò)增檢測成功321份，耐藥率高達(dá)676％，NRTIS和NNRTIS耐藥分別達(dá)到了5421％174321和6542％210321。NRTIS耐藥突變主要是TMAS突變和M184VNNRTIS耐藥突變中以K103N和Y181C最為常見，其次是G190AS和H221Y。Y181C和H221Y聯(lián)合突變在河北省和河南省的耐藥標(biāo)本中分別占到2333％730和1658％31187，K103NY181CH221Y在河北省和河南省耐藥標(biāo)本中分別占667％230和1176％22187。2未接受抗病毒治療的標(biāo)本擴(kuò)增檢測成功269份，基線耐藥率為743％深圳的基線耐藥為1786％，顯著高于其他地區(qū)X49327，P00264B亞型的基線耐藥顯著高于非B亞型P00177NNRTIS耐藥突變包括K103N、Y181C、V179DE、G190E和K238NPIS耐藥突變中包括能夠引起NFV高度耐藥的N88S、D30N和L90M。在這些標(biāo)本中，新報道的HIV1流行重組毒株CRF5501B在2009年廣州和深圳的男男性行為人群中的流行率為984％。結(jié)論受到樣本量和標(biāo)本保存的影響，部分地區(qū)的擴(kuò)增成功率較低，可能對結(jié)果有影響。本研究提供了部分地區(qū)抗病毒治療失敗耐藥和基線耐藥的概貌。河南和河北抗病毒治療失敗標(biāo)本中耐藥毒株的流行率非常高，嚴(yán)重地影響后續(xù)抗病毒治療效果。HIV1基線耐藥的流行受到地區(qū)和病毒亞型的影響。近年來增長的男男性行為人群中HIV1的亞型更為復(fù)雜。跟蹤基線耐藥病人的抗病毒治療效果有助于闡明基線耐藥對抗病毒治療的影響。第二部分HIV1特定基因突變的耐藥性鑒定HIV1的耐藥突變十分復(fù)雜，截止到2008報道的突變已經(jīng)達(dá)到200多個，且不斷有新的耐藥相關(guān)突變位點被發(fā)現(xiàn)和鑒定。在藥物選擇壓力下，一些病毒基因的天然多態(tài)性位點很容易轉(zhuǎn)變?yōu)槟退幭嚓P(guān)突變位點。目前，主要耐藥突變位點的作用已經(jīng)清楚，但對很多新出現(xiàn)的和由多態(tài)性位點轉(zhuǎn)變?yōu)槎鴣淼耐蛔兊哪退幾饔眉捌渑c主要突變之間的相互作用尚不明確。我國流行的HIV1毒株亞型、我國獨特的群體性治療模式使得耐藥突變的發(fā)生和流行具有鮮明的特點。本研究的目的是闡明在我國接受抗病毒治療的艾滋病患者中廣泛流行的H221Y對耐藥的作用及其與其他突變的相互作用。我們從3名臨床耐藥的艾滋病患者血漿標(biāo)本中擴(kuò)增獲得含有不同耐藥突變組合K103NY181CH221YT215Y、V179EY181CH221YT215Y、K101QY181CH221Y的3段HIV1POL區(qū)基因，以HIV1PNL43為骨架構(gòu)建重組病毒。以此為基礎(chǔ)，對特定位點進(jìn)行定點突變或回復(fù)突變、轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞（HUMANEMBRYONICKIDNEY，HEK293T），收獲病毒，構(gòu)建含有不同突變組合的21株病毒，在MT2細(xì)胞上對病毒進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，測定感染性滴度50％TISSUECULTUREINFECTIOUSDOSE，TCID50，在TZMBL細(xì)胞上測定這些病毒對4種抗HIV藥物的敏感性，以PNL43病毒上定點突變的3株病毒作為參比。每種藥物設(shè)11個濃度梯度、2復(fù)孔、重復(fù)3次，計算50％抑制濃度（50％INHIBITIONCONCENTRATION，IC50），采用析因設(shè)計的分析方法計算各個突變對耐藥的貢獻(xiàn)及突變之間的相互作用。結(jié)果1K103NT215Y顯著提高EFV對病毒的IC508898FOLD，V179ET215Y、Y181C和K101Q分別使EFV對病毒的IC50提高1846FOLD、612FOLD和676FOLD，H221Y單一突變幾乎不影響EFV的IC50值141FOLD。分別使EFV的IC50提高8898FOLD和1846FOLD的K103NT215Y和V179ET215Y聯(lián)合突變均與H221Y無交互作用，而分別使EFV的IC50提高612FOLD和676FOLD的Y181C和K101Q均與H221Y有顯著交互作用F1249，P00028F2810，P＜00001。H221Y可拮抗K101Q對EFV的耐藥作用，使其相對于野生型的IC50由提高676FOLD降低到二者相當(dāng)。2K103NT215Y和V179ET215Y均顯著提高AZT對病毒的IC50（3066FOLD，1372FOLD）。Y181C顯著的降低了AZT對病毒的IC500335FOLD。H221Y對IC50的影響隨著基礎(chǔ)突變變化較大。分別使AZT的IC50提高3066FOLD和1372FOLD的K103NT215Y和V179ET215Y聯(lián)合突變均與H221Y無交互作用，而分別使AZT的IC50改變0335FOLD和150FOLD的Y181C和K101Q均與H221Y有顯著交互作用F1871，P00051F1053，P00011。H221Y可拮抗Y181C對AZT的耐藥作用，使其相對于野生型的IC50由降低0335FOLD提高到二者相當(dāng)。3K101Q單一位點使3TC對病毒的IC50降低048FOLD，K103NT215Y、V179ET215Y和Y181C對3TC的IC50幾乎沒有影響（135FOLD、080FOLD、129FOLD）。H221Y對IC50的影響隨著基礎(chǔ)突變變化較大。H221Y可拮抗K101Q對3TC的耐藥作用，H221Y與V179ET215Y有顯著的拮抗作用。K101Q、K103NT215Y、V179ET215Y和Y181C均不會使D4T的IC50顯著改變，H221Y單一位點顯著提高D4T對病毒的IC50471FOLD。181和221之間不存在交互作用P09708。結(jié)論1我們首次采用析因分析設(shè)計實驗方法及分析檢驗方法發(fā)現(xiàn)了221單一位點突變對耐藥的貢獻(xiàn)及與其他位點的交互作用。2H221Y單一位點對D4T的耐藥顯著提高，對EFV的耐藥提高較小，對AZT和3TC的作用隨著一起出現(xiàn)的突變位點而不同。3Y181C單一位點顯著提高AZT的敏感性。4基礎(chǔ)突變分別對EFV和AZT耐藥的影響顯著時，H221Y單一位點對耐藥的作用及與基礎(chǔ)位點之間的交互作用不顯著。第三部分?jǐn)y帶耐藥相關(guān)突變的HIV1毒株的復(fù)制能力的研究HIV1耐藥突變可能使病毒的酶活性受損，導(dǎo)致復(fù)制能力下降，但病毒也可能發(fā)生補償突變，彌補復(fù)制能力的損失。本研究的目的是闡明攜帶常見耐藥突變的HIV1毒株的復(fù)制能力。我們采用平行培養(yǎng)的方法，將第二部分研究中構(gòu)建的病毒等量接種MT2細(xì)胞，在沒有藥物壓力的條件下培養(yǎng)10天，定期取培養(yǎng)上清接種TZMBL細(xì)胞，48小時HOURH后測定熒光值，以野生型PNI43為參比，繪制病毒的復(fù)制動力學(xué)曲線，用具有一個重復(fù)測量的兩因素定量資料的假設(shè)檢驗方法對結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果1PNL43179181215復(fù)制能力在MT2細(xì)胞上最強，第三和四天分別提高7169倍和13294倍。2培養(yǎng)第五天后幾乎所有耐藥毒株的復(fù)制能力都高于野生毒株（221倍數(shù)14569倍）。3Y181C和H221Y突變均使PNL43179215的復(fù)制能力在第6天和第7天顯著的提高P00066，P＜00001，P00363，P＜00001，在PNL43103215病毒攜帶的突變基礎(chǔ)上表現(xiàn)出相反的結(jié)果P＜00001。結(jié)論1首次發(fā)現(xiàn)攜帶突變V179EY181CT215Y、V179EH221YT215Y、V179ET215Y、K103NT215Y、K103NY181CT215Y的復(fù)制能力強于野生毒株。2復(fù)制能力的提高也可能是這些毒株耐藥的一個因素。3應(yīng)高度警惕高耐藥高復(fù)制的HIV1毒株的流行，進(jìn)行密切監(jiān)測。

簡介：呼吸道合胞病毒RESPIRATYSYNCYTIALVIRUS，RSV屬于副粘病毒科肺病毒屬，是世界范圍內(nèi)引起嬰幼兒下呼吸道感染的最常見病原體之一。在美國，據(jù)統(tǒng)計，每年有85000～144000的嬰兒因病毒性肺炎或毛細(xì)支氣管炎接受住院治療。除此之外，某些老年人群和免疫功能缺陷的成年人群也是RSV感染的主要對象。根據(jù)世界衛(wèi)生組織WHO的數(shù)據(jù)顯示，全球每年的呼吸道合胞病毒感染者約有6400萬例，而其中16萬例因感染并發(fā)癥死亡。經(jīng)過幾十年的努力，到目前為止依舊沒有安全、有效的疫苗可用于RSV感染的預(yù)防。因此，建立簡單、快速、靈敏的RSV實驗室檢測方法，對疾病的早期診斷、治療以及預(yù)防控制都具有非常重要的意義。呼吸道合胞病毒的檢測方法主要基于三個方面一是病毒的分離培養(yǎng)二是病毒核酸的檢測，三是病毒抗原或抗體的分析。雖然用組織培養(yǎng)分離病毒是目前診斷的最好方法或稱為金標(biāo)準(zhǔn)，但是培養(yǎng)周期長，敏感性差，操作復(fù)雜，不適于大量檢測。而病毒核酸檢測方法靈敏度高、快速，并且能同時分析大批量樣本，但卻需要價格昂貴的精密儀器和專業(yè)的技術(shù)人員操作，不適于普通實驗室或戶外檢測。免疫檢測技術(shù)因其特異性強、方法簡單等優(yōu)勢，在病毒抗原或抗體的檢測中得到廣泛的應(yīng)用。不過，由于靈敏度低，很難用于臨床RSV感染的早期診斷。為了解決上述問題，以實現(xiàn)RSV的高靈敏、簡操作、低成本、可視化分析，本文將貴金屬納米顆粒及金石墨烯納米復(fù)合物引入免疫分析技術(shù)，建立了一系列高靈敏的RSV檢測新方法。具體的研究工作如下1金銀納米顆粒在RSV免疫分析中的應(yīng)用1利用酶反應(yīng)產(chǎn)物作為信號分子的表面增強拉曼散射（SERS）免疫分析。銀納米顆粒AGNPS是常用的表面增強拉曼散射SERS活性基底。本文利用抗壞血酸及檸檬酸共還原氯化銀溶膠法制得分散性好且SERS活性強的AGNPS，并將其用于RSV的免疫分析中。在該免疫學(xué)反應(yīng)體系中，辣根過氧化物酶HRP在H2O2存在下催化底物TMB失去電子，得到氧化產(chǎn)物TMB。溶液中成離子狀態(tài)的TMB與帶負(fù)電AGNPS發(fā)生相互作用，化合物被吸附到AGNPS表面，產(chǎn)生強烈的SERS信號，實現(xiàn)對RSV的靈敏檢測。相較于傳統(tǒng)的ELISA顯色法，靈敏度提高50倍。另外，由于酶催化TMB顯色反應(yīng)被廣泛用于生化分析領(lǐng)域，因此利用酶反應(yīng)產(chǎn)物的SERS分析策略具有普適性。2金納米粒子信號放大高靈敏度的檢測RSV。金納米粒子AUNPS因具有合成簡單、比表面積大、負(fù)載效率高、性能穩(wěn)定、生物相容性好等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于生化分析領(lǐng)域。本文利用AUNPS作為辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記抗體的載體，以HRP催化H2O2氧化TMB的吸光度值來檢測RSV。由于AUNPS較大的比表面積可以增加酶標(biāo)抗體在其表面的吸附量，所以同傳統(tǒng)的ELISA相比，檢測信號增強，最低檢出濃度可以達(dá)到05PGML。另外該方法重復(fù)性好，選擇性強，構(gòu)建的免疫體系在3個星期內(nèi)都能夠穩(wěn)定存在，具有很好的應(yīng)用價值。3結(jié)合金納米層（GNPL）修飾的微孔板及酪胺信號放大TSA技術(shù)，建立雙信號放大策略實現(xiàn)對RSV的高靈敏檢測。在H2O2存在時，一些氧化酶（辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等）可以將底物酪胺催化后共價結(jié)合到周圍蛋白的富電子表面形成酪胺化復(fù)合物，大量富集成以酶為中心的類似“樹”狀的聚集團(tuán)，當(dāng)對酪胺進(jìn)行一定標(biāo)記后，可以將原始信號幾何級放大。本文以RSV為代表，首先采用化學(xué)鍍金的方式在微孔板表面制備金納米層，改善微孔對捕獲抗體的吸附能力，提高檢測靈敏度再利用TSA技術(shù)使HRP大量沉積，催化底物TMB顯色，進(jìn)一步放大檢測信號，實現(xiàn)RSV的高靈敏度分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，方法在005～30PGML范圍之間對RSV的響應(yīng)具有良好的線性關(guān)系。另外，將RSV分別加入細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清和人血清，回收率在906％～981％，說明該方法可用于復(fù)雜樣品中RSV的分析測定。2金石墨烯復(fù)合納米材料在RSV免疫分析中的應(yīng)用1利用HG2增強AUNPSGRAPHENE模擬酶活性實現(xiàn)對RSV的色度免疫分析據(jù)報道，納米材料包括碳納米材料、貴金屬納米顆粒、氧化鐵納米顆粒等都具有類似過氧化物酶的催化活性，即在H2O2存在下，能夠催化TMB等辣根過氧化物酶的底物發(fā)生氧化反應(yīng)，產(chǎn)生顏色變化。但是當(dāng)有生物分子比如蛋白質(zhì)、DNA吸附后，催化活性被完全抑制，限制了這類納米材料在分析化學(xué)中的應(yīng)用。本研究通過鞣酸一步合成AUNPSGRAPHENE復(fù)合物，發(fā)現(xiàn)該復(fù)合物具有模擬酶的性質(zhì)，添加HG2可以顯著增強其酶活性，即使是生物分子完全抑制其催化能力后?；诖?，建立RSV的色度免疫分析新方法。實驗結(jié)果表明，當(dāng)RSV濃度在01～10PGML的濃度范圍內(nèi)時，吸收值與RSV濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，最低檢出濃度為004PGML。2利用石墨烯和羥胺還原放大技術(shù)，建立超靈敏的等離子免疫分析方法用于病原體的檢測。GRAPHENE由于具有高的表面積，大量的金納米粒子可以在其表面沉積同時因為金納米顆粒能高效催化HAUCL4NH2OH氧化還原反應(yīng)，使AU原子沉積到AUNPS表面，導(dǎo)致AUNPS的尺寸由小變大。基于此，建立一種超靈敏的RSV等離子免疫分析方法。首先，通過簡單的水熱法一步合成AUNPSGRAPHENE納米復(fù)合物，利用AUNPS和GRAPHENE均易吸附蛋白的優(yōu)點，將抗體修飾于AUNPSGRAPHENE雜合體表面，并加入由固相載體RSV組成的微孔中形成三明治結(jié)構(gòu)，此時加入HAUCL4NH2OH溶液，微孔溶液的顏色發(fā)生變化，通過肉眼便可讀出結(jié)果，特別適合于資源有限的地區(qū)?？傊菊撐囊越疸y納米顆?；蚪鹗?fù)合納米材料的優(yōu)良性能建立了一系列RSV免疫分析新方法，不僅進(jìn)一步拓寬了金銀納米材料在免疫分析中的應(yīng)用，同時也為RSV感染的早期診斷以及治療方案的合理選擇都提供了新思路。

簡介：目的為研究細(xì)胞因子白介素18INTERLEUKIN18IL18的免疫調(diào)節(jié)作用和乙型肝炎病毒HEPATITISBVIRUSHBV感染慢性化病理機制的相關(guān)性本研究通過檢測慢性HBV感染相關(guān)性肝病患者肝臟組織中的IL18的表達(dá)情況分析其與HBV血清學(xué)標(biāo)記物、病毒載量、HBEAG狀態(tài)、ALT水平、病理分級以及臨床病理生理因素的關(guān)系探討IL18在慢性HBV感染中的作用機制。方法以乙型肝炎病毒感染相關(guān)性肝病患者及健康人作為研究對象。選取2012年1月至2012年12月在安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝病科及普外科住院患者共283例其中住院并行肝臟穿刺活檢的HBV感染患者225例分為慢性乙型肝炎172例乙肝后肝硬化53例于普外科行手術(shù)切除的乙肝后肝癌患者36例行手術(shù)切除且排除HBV感染的肝血管瘤患者22例作對照組。實驗采用半定量SP免疫組化法檢測上述人群肝臟組織中IL18的表達(dá)強弱情況。肝功能采用常規(guī)的生化方法檢測HBVDNA載量采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)POLYMERASECHAINREACTIONPCR方法HBV血清學(xué)標(biāo)記物相關(guān)指標(biāo)采用酶聯(lián)免疫吸附ENZYMELINKEDIMMUNOSBENTASSAYELISA法檢測。最后采用SPEARMAN秩相關(guān)分析肝臟組織中IL18表達(dá)與上述指標(biāo)有無相關(guān)性。結(jié)果1、IL18在肝臟組織中以肝細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)表達(dá)為主炎性細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞也有少量表達(dá)半定量分析結(jié)果顯示在CHB、肝硬化、HBV相關(guān)性肝癌組織中的IL18表達(dá)存在顯著差異P2、IL18在健康人群肝細(xì)胞中多數(shù)呈陽性、強陽性表達(dá)在CHB中以弱陽性表達(dá)為主兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義Χ242124P3、IL18在CHB肝組織的表達(dá)與病毒載量的高低無明顯相關(guān)性R005P0518與HBEAG水平高低亦無相關(guān)性R0041P0590。4、IL18在CHB肝組織中的表達(dá)與ALT水平高低呈正相關(guān)隨著ALT升高IL18的表達(dá)明顯增強R0182P0017。5、IL18在CHB肝臟組織中的表達(dá)與炎癥及纖維化程度均呈正相關(guān)關(guān)系R0173和0068P0024和0037。結(jié)論1、在慢性HBV感染相關(guān)性肝病患者肝臟組織中的IL18的表達(dá)存在顯著差異提示IL18表達(dá)強弱與HBV感染的免疫發(fā)病機制有關(guān)IL18參與HBV感染的慢性化、疾病的進(jìn)展及轉(zhuǎn)歸。2、隨著炎癥及纖維化程度加重以及ALT水平升高IL18在CHB患者肝臟組織中的表達(dá)均明顯上調(diào)說明IL18一定意義上可以作為一個強有力的免疫調(diào)劑劑和免疫增強劑在CHB病情進(jìn)展中起著重要作用。

簡介：目的糖尿病是當(dāng)代危害人類健康的三大疾病之一，糖尿病中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變是目前研究熱點之一，主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙如學(xué)習(xí)、記憶能力下降。氧化應(yīng)激是其重要發(fā)病機制之一。過氧化脂質(zhì)MALONDIALDEHYDE，MDA、超氧化物歧化酶SUPEROXIDEDISMUTASE，SOD、還原型谷胱甘肽GLUTATHIONE，GSH是反映體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平的經(jīng)典指標(biāo)。SOD、GSH均具有很強的抗氧化能力，谷氨酰半胱氨酸連接酶GLUTAMATECYSTEINELIGASE，GCL是GSH的合成限速酶，其催化亞基GCLC和調(diào)節(jié)亞基GCLM是非常重要的抗氧化蛋白酶，對抗氧化應(yīng)激能力的提高有重要作用。本實驗以Α硫辛酸為對照，觀察曲克蘆丁對認(rèn)知功能及氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)MDA，SOD，GSH，GCLC，GCLM的影響，為糖尿病認(rèn)知障礙治療提供新方向。方法1、STZ糖尿病大鼠模型制備雄性SPRAGUEDAWLEYSD大鼠，腹腔注射鏈脲佐菌素STREPTOZOTOCIN，STZ60MGKG，72小時后尾靜脈取血測血糖，血糖值大于等于167MMOLL者納入STZ糖尿病大鼠。2、分組SD大鼠共70只，150G170G，隨機分為正常對照組NC，10只，糖尿病組（DM，60只）動物成模后第12周，糖尿病組隨機分為生理鹽水組（DN，腹腔注射等體積生理鹽水，15只），糖尿病對照組DC，15只，Α硫辛酸干預(yù)組（DL，Α硫辛酸60MGKGD腹腔注射，15只），曲克蘆丁干預(yù)組（DT，曲克蘆丁60MGKGD腹腔注射，15只），均干預(yù)6周。3、一般觀察大鼠精神狀態(tài)，進(jìn)食量，進(jìn)水量，尿量，血糖，體重情況。4、行為學(xué)觀察分別于成模第1、12、18周行MRIS水迷宮實驗，記錄大鼠逃避潛伏期，分析各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。5、標(biāo)本制備及觀察指標(biāo)成模第18周（即給藥6周后），取新鮮海馬組織，用HE染色法觀察海馬組織結(jié)構(gòu)，應(yīng)用黃嘌呤氧化酶法測定海馬SOD的活力，硫代巴比妥酸法測定海馬MDA含量，雙縮脲法測定GSH含量，提取DNA并應(yīng)用REALTIMEPCR法檢測GCLC、GCLMMRNA的表達(dá)量，提取蛋白應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡WESTERNBLOT法檢測GCLC、GCLM蛋白含量。6、統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS130統(tǒng)計軟件包，對所測定結(jié)果進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗，應(yīng)用重復(fù)測量方差分析、多元方差分析及完全隨機設(shè)計的單因素方差分析統(tǒng)計數(shù)據(jù)，用X±S表示統(tǒng)計結(jié)果，P＜005為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1、一般情況觀察正常對照組大鼠皮毛純白有光澤，精神狀態(tài)良好，反應(yīng)靈敏，飲水量、進(jìn)食量及尿量正常，體重穩(wěn)步增長糖尿病組大鼠毛色稀疏枯黃污穢且無光澤，皮膚變薄，易激惹，精神萎靡，多尿、多飲、多食、體重明顯下降P＜005，血糖較正常組明顯升高P＜001。2、行為學(xué)觀察（MRIS水迷宮結(jié)果）成模第1周，糖尿病組與正常對照組間無顯著差別（P＞005）成模第12周（藥物干預(yù)前），糖尿病組較正常對照組逃避潛伏期明顯延長P＜005成模第18周（藥物干預(yù)6周后），Α硫辛酸干預(yù)組與曲克蘆丁干預(yù)組均較糖尿病對照組及糖尿病鹽水組逃避潛伏期明顯縮短，但仍高于正常對照組P＜005Α硫辛酸干預(yù)組與曲克蘆丁干預(yù)組間無顯著差異P＞005糖尿病鹽水組與糖尿病對照組間無顯著差異（P＞005），組別和天數(shù)之間不存在交互作用P＞005。3、海馬組織GCLMMRNA及蛋白的表達(dá)31、海馬組織GCLMMRNA的表達(dá)與正常對照組1±0相比，糖尿病對照組（0790±0012）、糖尿病鹽水組（0863±0097）海馬GCLMMRNA的表達(dá)顯著降低（P＜005）糖尿病對照組與糖尿病鹽水組間無顯著差異P＞005。與糖尿病對照組及糖尿病鹽水組相比，Α硫辛酸干預(yù)組（1510±0115）與曲克蘆丁干預(yù)組（1207±0011）海馬GCLMMRNA的表達(dá)顯著增高（P＜005）Α硫辛酸干預(yù)組GCLMMRNA表達(dá)高于曲克蘆丁干預(yù)組（P＜005）。32、海馬組織GCLM蛋白表達(dá)正常對照組（1±0）、糖尿病對照組（0999±0003）、糖尿病鹽水組（1000±0002）、Α硫辛酸干預(yù)組（0999±0001）、曲克蘆丁干預(yù)組（0999±0002）之間無明顯差異。4、海馬組織GCLCMRNA及蛋白的表達(dá)41、海馬組織GCLCMRNA及蛋白的表達(dá)與正常對照組（1±0）相比，糖尿病對照組（0642±0118）、糖尿病鹽水組（0660±0123）海馬GCLMMRNA的表達(dá)顯著降低P＜005糖尿病對照組與糖尿病鹽水組間無顯著差異（P＞005）。與糖尿病對照組及糖尿病鹽水組相比，Α硫辛酸干預(yù)組（1245±0128）與曲克蘆丁干預(yù)組（1181±0131）海馬GCLMMRNA的表達(dá)顯著增高P＜005Α硫辛酸干預(yù)組與曲克蘆丁干預(yù)組無顯著差異P＞005。42、海馬組織GCLC蛋白的表達(dá)與正常對照組（1±0）相比，糖尿病對照組（0989±0002）、糖尿病鹽水組（0989±0001）海馬GCLC蛋白水平顯著降低P＜005糖尿病對照組與糖尿病鹽水組間無顯著差異P＞005。與糖尿病對照組及糖尿病鹽水組相比，Α硫辛酸干預(yù)組（1009±0003）與曲克蘆丁干預(yù)組（1002±0001）海馬GCLC蛋白水平顯著增高（P＜005）Α硫辛酸干預(yù)組蛋白表達(dá)高于曲克蘆丁干預(yù)組P＜005。5、海馬組織中SOD活性及MDA、GSH含量測定51、SOD活性UMGPROT與正常對照組（115976±7581）相比，糖尿病對照組（61806±3942）、糖尿病鹽水組（68237±7632）海馬SOD活性明顯降低（P＜005）糖尿病對照組與糖尿病鹽水組間無顯著差異P＞005。與糖尿病對照組及糖尿病鹽水組相比，Α硫辛酸干預(yù)組（200331±6181）與曲克蘆丁干預(yù)組（191985±11421）海馬SOD活力明顯升高（P＜005），并且高于正常對照組P＜005Α硫辛酸干預(yù)組與曲克蘆丁干預(yù)組間無顯著差異（P＞005。52、MDA含量NMOLMGPROT與正常對照組（2737±0208）相比，糖尿病對照組（3841±0109）、糖尿病鹽水組3722±0196海馬MDA含量明顯升高（P＜005）糖尿病對照組與糖尿病鹽水組間無顯著差異（P＞005）。與糖尿病對照組及糖尿病鹽水組相比，Α硫辛酸干預(yù)組（2022±0228）與曲克蘆丁干預(yù)組（2534±0197）海馬MDA含量明顯降低P＜005曲克蘆丁干預(yù)組與正常對照組間無顯著性差別P＞005，Α硫辛酸干預(yù)組海馬MDA含量低于曲克蘆丁干預(yù)組及正常對照組P＜005。53、GSH含量MGGPROT糖尿病對照組（2117±0158）和糖尿病鹽水組（2114±0150）均低于正常對照組（2657±0207）（P＜001）糖尿病對照組和糖尿病鹽水組相比無統(tǒng)計學(xué)差異P＞005Α硫辛酸干預(yù)組（4337±0174）和曲克蘆丁干預(yù)組（3634±0177）與糖尿病對照組和糖尿病鹽水組相比均增高P＜001Α硫辛酸干預(yù)組高于曲克蘆丁干預(yù)組P＜001。6、HE染色結(jié)構(gòu)正常對照組大鼠海馬椎體細(xì)胞元排列整齊，形態(tài)完整糖尿病對照組及糖尿病鹽水組細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞膜及核仁模糊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，核固縮，細(xì)胞質(zhì)減少Α硫辛酸干預(yù)組及曲克蘆丁干預(yù)組較糖尿病對照組及糖尿病鹽水組上述改變明顯減輕。結(jié)論1、STZ糖尿病大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的海馬組織中重要的抗氧化物質(zhì)SOD、GSH顯著減低，合成GSH的關(guān)鍵酶GCLC、GCLM的表達(dá)亦減少氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生增加。2、Α硫辛酸可改善STZ糖尿病大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，提高海馬組織中SOD、GSH及GCLC、GCLM的表達(dá)，降低MDA的生成。3、曲克蘆丁亦可改善STZ糖尿病大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，其作用與Α硫辛酸相當(dāng)，但其在提高海馬組織中SOD、GSH、GCLC、GCLM表達(dá)及降低MDA生成的能力弱于Α硫辛酸。

簡介：蘇州大學(xué)學(xué)位論文獨創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明所提交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不含其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不含為獲得蘇州大學(xué)或其它教育機構(gòu)的學(xué)位證書而使用過的材料。對本文的研究作出重要貢獻(xiàn)的個人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人承擔(dān)本聲明的法律責(zé)任。論文作者簽名蘇州大學(xué)學(xué)位論文使用授權(quán)聲明本人完全了解蘇州大學(xué)關(guān)于收集、保存和使用學(xué)位論文的規(guī)定，即學(xué)位論文著作權(quán)歸屬蘇州大學(xué)。本學(xué)位論文電子文檔的內(nèi)容和紙質(zhì)論文的內(nèi)容相一致。蘇州大學(xué)有權(quán)向國家圖書館、中國社科院文獻(xiàn)信息情報中心、中國科學(xué)技術(shù)信息研究所含萬方數(shù)據(jù)電子出版社、中國學(xué)術(shù)期刊光盤版電子雜志社送交本學(xué)位論文的復(fù)印件和電子文檔，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存和匯編學(xué)位論文，可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索。涉密論文口本學(xué)位論文屬在年一月解密后適用本規(guī)定。非涉密論文叼論文作者簽名壓里世EL期論文作者簽名么釜坐如期導(dǎo)師簽名如以P壇9占日期紕吐形

簡介：河南中醫(yī)學(xué)院河南中醫(yī)學(xué)院２０１３２０１３屆碩士研究生學(xué)位論文屆碩士研究生學(xué)位論文病毒性肝炎病毒性肝炎肝硬化肝硬化舌下脈絡(luò)舌下脈絡(luò)與門脈寬度與門脈寬度及流速及流速、脾臟厚度脾臟厚度、結(jié)節(jié)結(jié)節(jié)相關(guān)性研究相關(guān)性研究研究生姓名研究生姓名王嘯導(dǎo)師導(dǎo)師段榮章教授指導(dǎo)組成員指導(dǎo)組成員趙文霞教授馬素平副主任醫(yī)師劉光偉副主任醫(yī)師學(xué)科、專業(yè)學(xué)科、專業(yè)中醫(yī)內(nèi)科學(xué)所屬院、部所屬院、部第一臨床醫(yī)學(xué)院中國﹒鄭州中國﹒鄭州２０２０１３１３年４月３０日年４月３０日

簡介：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位論文博士學(xué)位論文學(xué)校代碼學(xué)號10023ZB2010021人乳頭瘤病毒基因分型檢測參考物質(zhì)及其應(yīng)用研究所院學(xué)科專業(yè)姓名指導(dǎo)教師導(dǎo)師小組完成日期衛(wèi)生部臨床檢驗中心臨床檢驗診斷學(xué)張瑞李金明研究員王露楠研究員二零一三年五月一、一LJ／J北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位論文目錄英文縮略詞??????????????????????????????1中文摘要???????????????????????????????3英文摘要???????????????????????????????6第一部分HPV16和一18參考物質(zhì)的研究?????????????????9前言????????????????????????????????．99日U吾????????????????????????????????。1．材料和方法???????????????????????????121．1．實驗材料和試劑配制???????????????????????121．2．方法?????????????????????????????161．2．1．HPV16和．18全基因組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化????????????????161．2．2．HPV16和．18全基因組質(zhì)粒的提取????????????????171．2．3．反向點雜交法對全基因組質(zhì)粒HPV型別的驗證??????????181．2．4．HPV16和．18參考物質(zhì)的制備??????????????????181．2．5．均勻性實驗??????????????????????????181．2．6．穩(wěn)定性實驗??????????????????????????201．2．7．與國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的溯源定值??????????????????211．2．8．不確定度計算????????????????????????222．結(jié)果??????????????????????????????232．1．反向點雜交法對全基因組質(zhì)粒HPV型別的驗證???????????232．2．HPV16和．18參考物質(zhì)的制備??????????????????242．3．均勻性試驗??????????????????????????242．4．穩(wěn)定性試驗??????????????????????????282．5．與國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的溯源定值???????????????????402．6．不確定度結(jié)果?????????????????????????一473．討論??????????????????????????????49參考文獻(xiàn)?????????????????????????????一53第二部分HPV6、．11、．16、一18、．31、．33、．39、．51和．52樣本制備及其在HPV基因分型室間質(zhì)評中的應(yīng)用??????????????????????一57前言???????????????????????????????一5”／日U舌???????????????????????????????一1．材料和方法???????????????????????????611．1．實驗材料和試劑配制???????????????????????611．2．方法?????????????????????????????65

簡介：目的探討來氟米特LEF對人胚肺成纖維細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及可能的機制，并為LEF抗人巨細(xì)胞病毒HCMV作用提供理論依據(jù)。方法體外培養(yǎng)人胚肺成纖維細(xì)胞，實驗分為對照組、HCMV組GCVHCMV組以及LEFHCMV組，對照組用含002％DMSO的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，HCMV組加入HCMV，GCVHCMV干預(yù)組在人胚肺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中同時加入GCV和HCMV，LEFHCMV干預(yù)組在細(xì)胞培養(yǎng)液中同時加入LEF和HCMV，處理24H，48H后觀察細(xì)胞形態(tài)并攝相，收集人胚肺成纖維細(xì)胞用于實驗，采用MTT法檢測24H，48H各時間點人胚肺成纖維細(xì)胞的增殖變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測24H，48H和72H各時間點人胚肺成纖維細(xì)胞的凋亡變化。結(jié)果①加入HCMV后，人胚肺成纖維細(xì)胞的增殖被明顯抑制，與對照組比較具有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義P結(jié)論LEF對HCMV感染人胚肺成纖維細(xì)胞的損傷具有保護(hù)作用，LEF明顯抑制HCMV感染所致人胚肺成纖維細(xì)胞的凋亡及增殖作用，為闡明LEF抗HCMV感染的分子機制，對免疫功能低下狀態(tài)患者抗HCMV新途徑的研究提供理論依據(jù)。

簡介：人類免疫缺陷病毒HIV感染及其引起的艾滋病，是我國及全球所面臨的重大公共衛(wèi)生問題，嚴(yán)重危害人類健康。開發(fā)研制安全有效的HIV疫苗以及抗HIV藥物是控制HIV感染及艾滋病流行的重要措施。HIV1反式轉(zhuǎn)錄激活因子TRANSACTIVATOFTRANION，TAT是HIV1在感染早期產(chǎn)生的一種重要調(diào)節(jié)蛋白，在病毒復(fù)制和感染致病中起重要作用。在HIV感染細(xì)胞內(nèi)，TAT可反式激活病毒基因組轉(zhuǎn)錄的起始和延長，從而啟動和促進(jìn)病毒的復(fù)制。此外，分泌和釋放至細(xì)胞外的TAT還具有多樣的胞外活性，在艾滋病的免疫抑制、艾滋病腦病和KAPOSI肉瘤形成等致病中發(fā)揮重要作用，被稱為“病毒毒素”，也使得TAT成為HIV疫苗研究的重要候選抗原之一。已有研究表明，盡管天然TAT蛋白的序列在HIV1不同亞型毒株間具有高度的保守性，但其屬非折疊蛋白，結(jié)構(gòu)松散，使得天然TAT作為HIV疫苗的候選抗原尚存在誘發(fā)抗體尤其是免疫保護(hù)性抗體滴度低的問題。因此，本研究根據(jù)天然HIV1TAT分子各功能區(qū)特點及其親疏水性分析，對HIV1TAT蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，原核表達(dá)多種截短的TAT突變體蛋白及其與HCV核心蛋白HCVC高疏水區(qū)122191AA融合的重組抗原分別用全長TAT及TAT突變體蛋白制備金標(biāo)體顆粒，免疫C57BL小鼠進(jìn)行免疫原性分析嘗試用無細(xì)胞體外合成系統(tǒng)制備不同TAT突變體與HCVC122191融合的重組抗原，并經(jīng)透射電鏡鑒定其顆粒性特征，實驗結(jié)果將為進(jìn)一步研究HIV1TAT生物學(xué)功能及制備安全有效的TAT顆粒性免疫原奠定基礎(chǔ)。本研究分以下三個部分第一部分HIV1TAT突變體與HCV核心蛋白融合重組抗原的原核表達(dá)HIV1TAT蛋白可分為6個功能區(qū)N端區(qū)121AA、半胱氨酸富集區(qū)2237AA、核心區(qū)3847AA、堿性氨基酸富集區(qū)4857AA、谷氨酰胺富集區(qū)5872AA以及C端區(qū)73101AA）。在我們前期對TAT抗原結(jié)構(gòu)改造及免疫原性分析的基礎(chǔ)上，本研究結(jié)合對全長TAT蛋白親疏水性分析結(jié)果，首先構(gòu)建并原核表達(dá)了缺失TAT高疏水區(qū)3145AA的HIV1HXB2株TAT突變體融合蛋白PET32ATAT△3145?；痉椒ê徒Y(jié)果如下以質(zhì)粒PPEPTAT1101HCVC122191為模板，經(jīng)PCR和OVERLAPPCR獲得TAT△3145目的基因片段，構(gòu)建其原核表達(dá)質(zhì)粒PET32ATAT△3145，再將該重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入ECOLIBL21DE3中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果獲得高表達(dá)的截短的TAT突變體融合蛋白PET32ATAT△3145，其相對分子量約為27，600，其表達(dá)量約占菌體總蛋白的55％，明顯高于全長TAT和其他TAT突變體蛋白的原核表達(dá)量。此外，本研究還利用本實驗室前期正確構(gòu)建保存的不同HIV1TAT重組表達(dá)質(zhì)粒（PET32ATAT1101，PET32ATAT2286，PET32ATAT22101PPEPTIDE2TAT121PPEPTIDE2TAT3861和PPEPTIDE2TAT60101，同上經(jīng)原核表達(dá)，分別獲得相對應(yīng)的全長TAT及其突變體融合蛋白，作為本研究中對照及檢測用蛋白用NINTA親和層析法純化上述目的融合蛋白。WESTERNBLOT鑒定結(jié)果顯示，PET32ATAT1101和PET32ATAT△3145融合蛋白均與小鼠抗TATN末端單克隆抗體呈特異性反應(yīng)，而PET32A載體蛋白則無此反應(yīng)。在此基礎(chǔ)上，選擇具有自我組裝功能的HCV核心蛋白HCVC高疏水區(qū)122191AA為載體，制備不同TAT突變體與HCVC122191融合的重組抗原。方法是經(jīng)PCR對編碼HCVC122191基因進(jìn)行大腸桿菌喜愛密碼子優(yōu)化，以O(shè)VERLAPPCR將TAT△3145與HCVC122191DNA片段拼接后，克隆至原核表達(dá)載體PPEPTIDE2中，構(gòu)建原核重組表達(dá)質(zhì)粒PPEPTIDE2TAT△3145HCVC122191。將該重組表達(dá)質(zhì)粒及本室前期構(gòu)建正確的2種TATHCVC重組質(zhì)粒PPEPTAT1101HCVC122191和PPEPTAT2286HCVC122191轉(zhuǎn)入ECOLIBL21DE3中，經(jīng)常規(guī)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)（37℃誘導(dǎo)35H），用12％SDSPAGE凝膠電泳檢測，結(jié)果未獲得目的表達(dá)條帶。隨后用低溫長時間IPTG誘導(dǎo)方法，即在30℃條件下，在表達(dá)菌株ECOLIBL21DE3中，分別經(jīng)IPTG誘導(dǎo)10H表達(dá)3種TATHCVC重組原核表達(dá)質(zhì)粒PPEPTAT△3145HCVC122191PPEPTAT1101HCVC122191和PPEPTAT2286HCVC122191，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)12％SDSPAGE凝膠電泳檢測，結(jié)果仍未觀察到HIV1TATHCVC122191重組蛋白表達(dá)條帶，未獲得預(yù)期實驗結(jié)果。第二部分HIV1TAT及其突變體蛋白的金標(biāo)體顆粒制備與免疫原性分析為解決第一部分中HIV1TATHCVC122191融合重組抗原經(jīng)原核系統(tǒng)表達(dá)未得到預(yù)期陽性結(jié)果的問題，本研究同時進(jìn)行了TAT及其突變體金標(biāo)體顆粒的制備（第二部分）以及用無細(xì)胞體外合成系統(tǒng)表達(dá)TATHCVC122191融合顆粒性抗原（第三部分）。第二部分研究首先用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液，經(jīng)分光光度計和透射電鏡檢測鑒定，獲得分散度和均一度均較好的兩種金顆粒平均顆粒大小分別約755NM和325NM。將TAT及3種TAT突變體融合蛋白PET32ATAT△3145、PET32ATAT22101和PET32ATAT2286）分別標(biāo)記755NM膠體金顆粒，用NAC1聚沉實驗檢測在不同PH條件下TAT及其突變體蛋白金標(biāo)體復(fù)合物的穩(wěn)定性分別用上述TAT蛋白及其金標(biāo)體復(fù)合物免疫C57BL小鼠，制備小鼠抗血清，經(jīng)ELISA方法檢測小鼠免疫抗血清抗體滴度以及與TAT不同肽段的反應(yīng)性。實驗結(jié)果表明，全長TAT1101和TAT△3145蛋白金標(biāo)體溶液分別在PH55～95、PH55～110范圍內(nèi)較好地保持其穩(wěn)定性，TAT22101和TAT2286蛋白金標(biāo)體溶液分別在PH40～95、PH4595較好地保持其穩(wěn)定性。ELISA檢測結(jié)果顯示，所有實驗組均能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗全長TAT免疫抗血清，其中TAT1101金標(biāo)體組抗TAT小鼠抗血清滴度最高1，024，000，顯著高于TAT1101蛋白組和其他免疫組當(dāng)TAT△3145標(biāo)記膠體金后其誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗TAT抗體滴度明顯提高，表明膠體金標(biāo)記對全長TAT和TAT△3145突變體蛋白免疫原性的增強作用明顯。表位分析結(jié)果顯示，全長TAT1101蛋白標(biāo)記膠體金后的免疫反應(yīng)增強作用，主要是誘導(dǎo)產(chǎn)生抗TATN端表位的抗體抗TAT2286蛋白和抗TAT2286金標(biāo)體兩者小鼠抗血清與TAT3861和TAT60101的反應(yīng)性達(dá)到抗全長TAT小鼠抗血清水平抗TAT22101金標(biāo)體小鼠抗血清與TATC末端60101AA的反應(yīng)性明顯增強，明顯高于抗全長TAT抗血清與TAT60101的反應(yīng)性抗TAT△3145金標(biāo)體小鼠抗血清與TAT121、TAT3861和TAT60101三個肽段的結(jié)合作用均顯著增強，也達(dá)到抗全長TAT或抗全長TAT金標(biāo)體抗血清水平。上述結(jié)果表明，本研究制備的3種TAT突變體融合蛋白TAT22101、TAT2286和TAT△3145金標(biāo)體顆粒均較好地保留了免疫原性，且可誘導(dǎo)產(chǎn)生針對TAT不同功能區(qū)表位的抗體，為聯(lián)合應(yīng)用TAT表位抗原制備新型HIVTAT疫苗奠定試驗基礎(chǔ)。第三部分HIV1TAT突變體與HCVC122191融合顆粒性抗原的無細(xì)胞體外表達(dá)與鑒定該部分嘗試用無細(xì)胞體外合成系統(tǒng)表達(dá)TAT及其突變體與HCVC122191融合的顆粒性抗原。方法是用OVERLAPPCR將TAT1101、TAT186、TAT22101、TAT2286和TAT△3145分別與HCVC122191DN△片段進(jìn)行拼接，經(jīng)NCOI和BAMHI雙酶切及序列測定正確后，分別克隆至大腸桿菌無細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒PIVEX24D中，構(gòu)建5種重組無細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒PIVEX24DTAT1101HCVC122191、PIVEX24DTAT186HCVC122191、PIVEX24DTAT22101HCVC122191、PIVEX24DTAT2286HCVC122191和PIVEX24DTAT△3145HCVC122191用基于大腸桿菌細(xì)胞裂解液的無細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)進(jìn)行融合蛋白的表達(dá)，經(jīng)12％SDSPAGE和WESTERNBLOT鑒定表達(dá)產(chǎn)物，用透射電鏡檢測表達(dá)的HIV1TATHCVC122191重組蛋白的顆粒性特征。實驗結(jié)果表明，2種TATHCVC重組蛋白（TAT22100HCVC122191和TAT2286HCVC122191）表達(dá)產(chǎn)物出現(xiàn)表達(dá)條帶，分子量大小分別約1610KDA和1435KDA，與理論值相符。WESTERNBLOT鑒定結(jié)果顯示，TAT22101HCVC122191和TAT2286HCVC122191融合蛋白均與小鼠抗TAT單克隆抗體ANTIHIV1TATANTIBODY7181呈陽性特異性結(jié)合反應(yīng)。負(fù)染法透射電鏡檢測結(jié)果表明，2種TATHCVC重組蛋白（TAT22101HCVC122191和TAT2286HCVC122191）均具有明顯顆粒性特征，直徑大小分別約175±30MM和188±39NM，而對照組蛋白（TAT2286和TAT22101）未見顆粒樣結(jié)構(gòu)，表明高疏水性HCVC122191保持了良好的自組裝功能，TAT突變體蛋白與之融合后可形成新型TAT顆粒性抗原。總結(jié)1成功構(gòu)建缺失HIV1TAT高疏水區(qū)3145AA的TAT突變體原核表達(dá)質(zhì)粒，并獲得高表達(dá)的TAT突變體重組蛋白PET32ATAT△3145，提示TAT高疏水區(qū)3145AA對HIV1TAT及TAT突變體蛋白的表達(dá)有一定的抑制作用。2經(jīng)酶切鑒定和序列測定證實構(gòu)建正確的3種TAT與HCV核心蛋白HCVC高疏水區(qū)（122191AA）DNA序列重組的原核表達(dá)質(zhì)粒PPEPTIDE2TAT△3145HCVC122191、PPEPTAT1101HCVC122191和PPEPTAT2286HCVC122191轉(zhuǎn)入ECOLIBL21DE3菌株中，用常規(guī)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)（37℃誘導(dǎo)35H）和低溫長時間IPTG誘導(dǎo)表達(dá)30℃誘導(dǎo)10H均未觀察到目的表達(dá)條帶，未獲得預(yù)期實驗結(jié)果。3膠體金標(biāo)記對全長TAT和TAT△3145突變體蛋白免疫原性有明顯增強作用制備的3種TAT突變體融合蛋白PET32ATAT△3145、PET32ATAT22101和PET32ATAT2286金標(biāo)體顆粒均保留了較好的免疫原性，其中抗TAT△3145金標(biāo)體小鼠抗血清與三個TAT肽段（TAT121、TAT3861和TAT60101）的結(jié)合作用均顯著增強，達(dá)到抗全長TAT蛋白或抗全長TAT金標(biāo)體小鼠抗血清水平抗TAT2286金標(biāo)體小鼠抗血清與TAT3861和TAT60101的反應(yīng)性也達(dá)到抗全長TAT小鼠抗血清水平而抗TAT22101金標(biāo)體小鼠抗血清與TATC末端60101AA的反應(yīng)性則明顯高于抗全長TAT抗血清與TAT60101的反應(yīng)性，表明本研究制備的TAT突變體蛋白金標(biāo)體顆?？烧T導(dǎo)產(chǎn)生較強的針對TAT不同功能區(qū)表位的抗體，有可能具有阻斷天然TAT蛋白的反式轉(zhuǎn)錄激活等生物學(xué)活性的作用。4構(gòu)建5種HIV1TATHCVC122191重組無細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒PIVEX24DTAT1101HCVC122191PIVEX24DTAT186HCVC122191PIVEX24DTAT22101HCVC122191PIVEX24DTAT2286HCVC122191和PIVEX24DTAT△3145HCVC122191，經(jīng)無細(xì)胞合成系統(tǒng)表達(dá)，成功獲得兩種以HCVC122191為疏水核心的納米級新型TAT突變體顆粒性抗原TAT2286HCVC122191和TAT22101HCVC122191，實驗結(jié)果不僅為深入研究HIV1TAT生物學(xué)功能以及研發(fā)安全有效的基于TAT的HIV1疫苗奠定基礎(chǔ)，同時顯示HCVC122191有望作為一種有效載體也有可能為其他病原體顆粒性疫苗的研究提供新的途徑。

簡介：中圖分類號學(xué)校代碼10055密級公開尚7筒‘火謦碩士學(xué)位論文高危型人乳頭瘤病毒載量及多功能醋酸白在宮頸病變篩查中的診斷價值研究STUDYONTHEVALUEOFHIGHRISKHUMANPAPILLOMAVIRUSLOADANDMULTIFUNCTIONALVINEGARSOLUTIONINTHECERVICALLESIONSCEENING答辯委員會主席孟元光南開大學(xué)研究生院二O一三年五月南開大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行研究工作所取得的研究成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本學(xué)位論文的研究成果不包含任何他人創(chuàng)作的、已公開發(fā)表或者沒有公開發(fā)表的作品的內(nèi)容。對本論文所涉及的研究工作做出貢獻(xiàn)的其他個人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明的法律責(zé)任由本人承擔(dān)。學(xué)位論文作者簽名簦婪塞2013年5月23日非公開學(xué)位論文標(biāo)注說明本頁表中填寫內(nèi)容須打印根據(jù)南開大學(xué)有關(guān)規(guī)定，非公開學(xué)位論文須經(jīng)指導(dǎo)教師同意、作者本人申請和相關(guān)部門批準(zhǔn)方能標(biāo)注。未經(jīng)批準(zhǔn)的均為公開學(xué)位論文，公開學(xué)位論文本說明為空白。論文題目申請密級口限制≤2年口秘密≤10年口機密≤20年保密期限20年月日至20年月日審批表編號批準(zhǔn)日期20年月日南開大學(xué)學(xué)位評定委員會辦公室蓋章有效注限制★2年可少于2年秘密★10年可少于10年機密★20年可少于20年

簡介：點擊查看更多漢坦病毒β3整合素受體拮抗劑的篩選及其特性的初步鑒定.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文天津市青少年對錯（牙合）畸形認(rèn)知狀況的調(diào)查研究姓名李琴琴申請學(xué)位級別碩士專業(yè)口腔醫(yī)學(xué)；口腔臨床醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師高輝201205天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文有正畸治療經(jīng)歷的學(xué)生更能認(rèn)識到錯猞畸形的不良影響滬O．05，對正畸治療的態(tài)度也更積極儼0．01；對牙齒外觀和面部美觀的滿意度與認(rèn)知水平成負(fù)相關(guān)尸O．05；對牙齒排列的關(guān)注度與認(rèn)知水平成正相關(guān)尸O．05。結(jié)論1．自行編制的青少年錯猞畸形認(rèn)知調(diào)查問卷信效度較好，基本上能夠滿足心理測量學(xué)的要求；2．天津市青少年錯猞畸形相關(guān)知識了解不夠深入，他們對牙齒狀況的關(guān)注度以及對錯猞畸形影響美觀的認(rèn)知度較高，正畸治療態(tài)度積極，但是對錯拾畸形病因、錯袷畸形特征的認(rèn)識相對薄弱。3．性別、年齡、正畸治療經(jīng)歷、對牙齒外觀的滿意度、對面部美觀的滿意度以及對牙齒排列的關(guān)注是影響青少年對錯猞畸形基礎(chǔ)知識認(rèn)知的因素。關(guān)鍵詞青少年錯猞畸形認(rèn)知問卷調(diào)查信度效度

簡介：點擊查看更多人細(xì)小病毒B19 VP1獨特區(qū)蛋白對心肌細(xì)胞的影響及機制.pdf精彩內(nèi)容。