簡介：點擊查看更多柯薩奇病毒B3 VP1蛋白的原核表達及免疫效果觀察.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：目的制備雙砷染料標(biāo)記的熒光乙型肝炎病毒（HEPATITSBVIRUSHBV）體，對其形態(tài)學(xué)進行鑒定分析，并動態(tài)觀察HBV熒光體在活細胞中的生物學(xué)行為。方法采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法，將已成功構(gòu)建帶有TC標(biāo)簽的13倍乙型肝炎病毒基因組的載體質(zhì)粒（PTHBV13MTC1）瞬時轉(zhuǎn)染入人肝癌細胞株中，該重組載體是通過PCR定點基因突變技術(shù)將一個能與雙砷熒光染料特異性結(jié)合的TC標(biāo)簽（CCPGCC在基因水平上插入到HBV核心蛋白免疫主區(qū)CEL位點。48H后通過間接免疫熒光檢測表面抗原在細胞內(nèi)的表達與分布；酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測細胞培養(yǎng)上清液中乙肝表面抗原HBSAG的表達；同時收集轉(zhuǎn)染細胞上清液，經(jīng)不連續(xù)蔗糖密度梯度離心進行分離和純化后，加抗體孵育進行免疫電鏡觀察分析，同等培養(yǎng)條件下HEPG2細胞和2215細胞培養(yǎng)上清液分別作為陰性和陽性對照?；罴毎芯恐?，我們應(yīng)用EGONGREEN488TAXOL標(biāo)記微管骨架后，在活細胞時差共聚焦顯微鏡下觀察熒光HBV病毒體在宿主細胞中的運輸過程。結(jié)果間接免疫熒光結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)染PTHBV13MTC1組細胞中雙砷的紅色熒光強于轉(zhuǎn)染PTHBV13細胞組，呈典型的核漿型分布。電鏡結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染PTHBV13組細胞在48H時可表達HBSAG并可自行組裝成12NM左右的球形顆粒后分泌至上清中，而陰性對照組和PTHBV13MTC1組未見到與文獻報道一致的HBV顆粒樣結(jié)構(gòu)?；罴毎麜r差共聚焦顯微鏡觀察顯示熒光HBV顆粒感染HEPG2細胞后約3H熒光顆粒開始吸附并侵入胞內(nèi)，約5H時在胞漿中富集而少數(shù)已到達核周，并可觀察到熒光HBV顆粒依賴于微管的運動。初步證實重組的HBV熒光體同野生型HBV一樣保留了抗原性和感染性。結(jié)論TC嵌合型核心蛋白在轉(zhuǎn)染PTHBV13MTC1細胞中能夠特異性的發(fā)出熒光，且TC標(biāo)簽的插入并不影響表面抗原及核心蛋白的表達。雙砷復(fù)合物這一新穎熒光標(biāo)記技術(shù)使得HBV在活細胞中的示蹤觀察成為可能。在深入研究HBV熒光體在胞漿中運輸?shù)膭討B(tài)過程及與宿主細胞間的相互關(guān)系方面，可作為一種高度有價值的研究工具。

簡介：目的研究尿酸URICACID，UA聯(lián)合HBSAG負載的樹突狀細胞疫苗接種小鼠后產(chǎn)生的抗乙肝病毒HBV免疫效應(yīng)，包括HBSAG特異性細胞毒性T細胞CTL殺傷效應(yīng)，T淋巴細胞增殖反應(yīng)，TH1TH2型細胞因子的分泌等。并對尿酸促進DC成熟與功能提高的機理進行探討。方法1體外分離小鼠骨髓細胞，使用RMGMCSF、RMIL4誘導(dǎo)分化為DC，以UA或LPS刺激其成熟。分不同劑量尿酸組70ΜGML、100ΜGML、200ΜGML、400ΜGML，LPS組、RMPI1640培養(yǎng)基對照組。用流式細胞儀技術(shù)檢測DC細胞表面分子CD11C、CD83、CD86、IAIE的表達，用MTT法檢測DC刺激同基因小鼠T淋巴細胞的增殖反應(yīng)；ELISA法測定DC上清IL12P70的分泌水平。2尿酸體外刺激未成熟DC48小時，提取DC總RNA。RTPCR方法檢測TLR2MRNA、TLR3MRNA、TLR4MRNA、IL12P70MRNA等的表達。3使用尿酸或聯(lián)合抑制劑P38MAPK抑制劑SB203580、ERK12抑制劑PD98059、JNK抑制劑SP600125、NFΚB抑制劑PDTC體外刺激未成熟DC。在0MIN、15MIN、30MIN、45MIN時，分別提取DC細胞總蛋白與核蛋白。免疫印跡方法檢測DCPP38、PERK12、PJNK、NFΚBP65表達量。分別使用SB203580、PD98059、SP600125、PDTC與尿酸聯(lián)合刺激DC48H后，收集細胞，用流式細胞儀技術(shù)檢測DC細胞表面分子CD83、CD86、IAIE的表達；收集DC培養(yǎng)上清，ELISA法測定IL12P70的水平。4DC體外負載HBSAG，聯(lián)合尿酸接種正常BALBC小鼠。尾靜脈注射方式接種，DC接種數(shù)量為1106每只小鼠，每周接種一次，共兩次。分高、中、低劑量分別為400ΜG、200ΜG、100ΜG尿酸聯(lián)合HBSAGDC組、負載或未負載HBSAG的DC單獨接種組、尿酸單獨接種組200ΜG及PBS對照組。同時以負載HBS2839的DC單獨或聯(lián)合尿酸免疫小鼠，作為平行對照觀察組。一周和兩周時，以體內(nèi)熒光測定CTL活性方法，用流式細胞儀檢測特異性CTL活性；免疫兩周時，取小鼠脾T淋巴細胞，CFSE染色，體外以HBSAG或HBS2839刺激培養(yǎng)72H后，流式細胞儀測定其增殖反應(yīng)；取小鼠脾淋巴細胞體外HBSAG或HBS2839刺激培養(yǎng)72H后，以ELISA法測定細胞上清IL4和IFNΓ的分泌水平。結(jié)果1通過鑒定體外成功誘導(dǎo)培養(yǎng)出DC。尿酸濃度為400ΜGML、200ΜGML、100ΜGML時能增強DC細胞表面CD83、CD86、IAIE分子表達率；提高IL12P70分泌水平與陰性對照組相比，P＜005；尿酸能增強DC刺激T細胞增殖能力與陰性對照組相比，P值均小于005；尿酸濃度為70ΜGML時，細胞表面分子表達、IL12P70分泌水平、刺激T細胞增殖作用與陰性對照組比較均無明顯差別P＞005。UA促進DC成熟的能力呈尿酸劑量依賴性增強。2RTPCR結(jié)果示尿酸組與培養(yǎng)基對照組相比，TLRSMRNA表達出現(xiàn)明顯的變化。TLR2MRNA、TLR3MRNA、TLR4MRNA表達下降P＜005，以TLR4MRNA下降最明顯；IL12P70表達顯著增高P＜005；與LPS組相比，TLRSMRNA與IL12P70MRNA表達水平相似，無統(tǒng)計學(xué)差異，P＞005。31免疫印跡示，尿酸刺激后，15MIN時，PP38、PERK12、PJNK、NFΚB表達量明顯增加，30MIN時達到最大值，45MIN時則開始下降，與DMSO對照組相比，P值均小于005。使用相應(yīng)抑制劑后，相關(guān)蛋白表達表不能測出。LPS組上述分子在45MIN時仍大量表達。2與未用相應(yīng)抑制劑相比，使用SB203580、SP600125、PDTC等抑制劑預(yù)處理后，CD83、CD86、IAIE表達及IL12P70分泌水平均出現(xiàn)下降P＜005或001，其中，以SB203580的作用最明顯；使用PD98059后，CD83、CD86、IAIE表達及IL12P70分泌水平則出現(xiàn)上升P＜005。41免疫后一周或兩周，HBSAG特異性CTL，以負載HBSAG的DC聯(lián)合尿酸400ΜG、200ΜG、100ΜG接種組殺傷效應(yīng)最強，400ΜG尿酸聯(lián)合組一周時為3245％±1163％，兩周時為7456％±1238％；與DC對照組相比，均具有顯著性差異，P＜005。DC對照組殺傷效應(yīng)，一周時為1433％±204％，兩周時為2818％±238％，與其它對照組相比，均具有顯著性差異，P＜005；單獨尿酸免疫組、UNPULSEDDC組的HBSAG特異性CTL殺傷效應(yīng)與PBS對照組無顯著性差異，P＞005。HBSAG負載的DC免疫各組與HBS2839負載各組，特異性CTL殺傷效應(yīng)，無明顯差異，P＞005。荷肽或抗原DC免疫產(chǎn)生的特異性CTL殺傷效應(yīng)呈尿酸劑量依賴性升高，與尿酸的接種次數(shù)亦有關(guān)。2免疫后兩周，脾臟T細胞增殖反應(yīng)，以負載HBSAGDC聯(lián)合尿酸400ΜG、200ΜG、100ΜG接種組最強，PI值為1764±0114；與DC對照組相比，均具有顯著性差異，P＜005。DC對照組脾臟T細胞增殖反應(yīng)，PI值為1342±0093，與其它對照組相比，均具有顯著性差異，P＜005；單獨尿酸免疫組、UNPULSEDDC組，脾臟T細胞增殖反應(yīng)與正常對照組無顯著性差異，P＞005。HBSAG負載的DC免疫各組與HBS2839負載DC免疫各組，脾臟T細胞增殖反應(yīng)，無明顯差異，P＞005。荷肽或抗原DC免疫后脾臟T細胞增殖反應(yīng)呈尿酸劑量依賴性升高。3免疫后兩周，負載HBSAG的DC聯(lián)合尿酸400ΜG、200ΜG、100ΜG接種組IFNΓ水平最高，IL4水平最低，與DC對照組相比，均具有顯著性差異，P＜005；400ΜG尿酸聯(lián)合HBSAGDC免疫組IFNΓ、IL4水平分別為552361±24034PGML，14265±1333PGML。DC對照組脾臟細胞IFNΓ水平和IL4水平，高于其它對照組，分別為266575±51324PGML，22385±2252PGMLP＜005；單獨尿酸免疫組、UNPULSEDDC組，脾臟細胞IFNΓ水平和IL4水平與正常對照組相比無明顯變化P＞005。HBSAG負載的DC免疫各組和HBS2839負載各組，IFNΓ和IL4水平，無明顯差異，P＞005。荷肽或抗原DC免疫后脾臟細胞分泌的IFNΓ和IL4水平呈尿酸劑量依賴性。結(jié)論1對體外培養(yǎng)誘導(dǎo)擴增的DC，尿酸可促進其成熟，提高表面共刺激分子表達；能增強其刺激T細胞增殖能力和分泌IL12P70的水平。UA的這些活性呈劑量依賴性。2尿酸能調(diào)節(jié)未成熟樹突細胞TLR2MRNA、TLR3MRNA、TLR4MRNA等受體MRNA及IL12P70MRNA表達。此可能為其誘導(dǎo)DC成熟及免疫功能提高的機理之一。3未成熟樹突狀細胞P38、ERK12、PI3K、NFΚB等信號分子可由尿酸刺激磷酸化，相應(yīng)信號分子抑制劑可抑制尿酸這種刺激作用。阻斷相應(yīng)上述信號分子通路，可對尿酸誘導(dǎo)的樹突狀細胞活性產(chǎn)生影響。阻斷P38、JNK、NFΚB等信號通路能抑制尿酸對樹突狀細胞CD83、CD86、IAIE等分子表達及IL12P70分泌的上調(diào)作用；阻斷ERK12信號通路能增強尿酸對樹突狀細胞CD83、CD86、IAIE等分子表達及IL12P70分泌的上調(diào)作用。尿酸可以調(diào)節(jié)P38、ERK12、JNK、NFΚB等信號分子的活化，從而促進DC表面分子表達及IL12P70分泌。此可能為尿酸能誘導(dǎo)DC成熟及免疫功能提高的機理之一。4聯(lián)合尿酸免疫接種，可增強負載HBSAG或S2839的樹突狀細胞疫苗接種所誘導(dǎo)抗HBV的T細胞免疫應(yīng)答，包括HBSAG特異性CTL、IFNΓ細胞因子的分泌、對T淋巴細胞的增殖能力。這些免疫效應(yīng)的增強呈尿酸劑量依賴性。

簡介：背景大面積骨缺損一直是創(chuàng)傷骨科的治療難題。自體骨、異體骨，以及人工骨材料的填充都難以有效治療大面積的骨缺損。骨組織工程通過整合支架材料、種子細胞、活性因子等提高人工骨材料的成骨活性，達到修復(fù)大面積骨缺損的目的。其中骨髓間充質(zhì)干細胞作為種子細胞，在骨修復(fù)與重建中可分化為成骨細胞、骨細胞，繼而促進骨愈合。RUNX2在成骨分化的信號途徑中起核心作用，能誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞定向分化并成熟，從而促進骨修復(fù)。目的本次實驗利用重組RUNX2基因的慢病毒感染骨髓間充質(zhì)干細胞，使RUNX2基因在骨髓間充質(zhì)干細胞中表達水平增高，檢測其成骨相關(guān)基因表達的水平，觀察RUNX2基因促進骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的情況。方法從骨肉瘤細胞系MG63中抽提總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄PCR擴增RUNX2基因，通過酶切與連接的方法把RUNX2基因連接到慢病毒表達載體質(zhì)粒PEZLV201。然后和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，進行病毒的包裝，以熒光法行慢病毒滴度測定。取4周齡SD大鼠脛骨，用全骨髓細胞培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞。利用流式細胞儀檢測骨髓間充質(zhì)干細胞陽性表面標(biāo)記物CD90和CD105，驗證培養(yǎng)細胞為骨髓間充質(zhì)干細胞。預(yù)實驗得到最佳感染復(fù)數(shù)為50。將RUNX2重組慢病毒感染骨髓間充質(zhì)干細胞。通過鏡下觀察，RTPCR檢測成骨基因的表達情況，驗證RUNX2重組慢病毒促進BMSCS的成骨分化。結(jié)果1通過反轉(zhuǎn)錄成功獲得目的基因RUNX2基因。RUNX2基因與表達載體質(zhì)粒連接后，經(jīng)過酶切和測序鑒定正確。2熒光鏡下觀察，A組（含01ΜL病毒液）、B組（含05ΜL病毒液）、C組（含20ΜL病毒液）、D組（含10ΜL病毒液）、E組（含50ΜL病毒液）平均每視野范圍內(nèi)熒光細胞數(shù)分別為2個、8個、27個、163個、721個，經(jīng)計算A、B、C、D、E的病毒液滴度分別為2109TUML、16109TUML、135109TUML、163109TUML、145109TUML，取平均數(shù)，可得到慢病毒液滴度為16109TUML。F組（空載對照組）未發(fā)現(xiàn)綠色熒光細胞。3鏡下觀察第三代培養(yǎng)細胞呈長梭形、紡錘形及多角形貼壁生長，符合骨髓間充質(zhì)干細胞的形態(tài)特征。流式細胞儀檢測骨髓間充質(zhì)干細胞陽性表面標(biāo)記物CD90和CD105，表達率分別為998％、993。說明骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)成功。4慢病毒感染BMSCS后，實驗組（BMSCSRUNX2）細胞胞體變大，呈多角形、鱗片形，胞漿變多，細胞核增大，可有多核；而對照組（CONTROLBMSCS）細胞形態(tài)未見明顯改變，說明RUNX2重組慢病毒促BMSC成骨分化。5實驗組（BMSCSRUNX2）RUNX2、OCN、OSTEONECTIN、ALP、BMP2、OPN等成骨特異性基因的表達水平隨時間推移而增高，在第14天時達到最高；其中BMP2表達最強；對照組（BMSCS）上述基因無表達。說明RUNX2重組慢病毒可使骨髓間充質(zhì)干細胞高表達RUNX2基因，并促進骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化。結(jié)論利用RUNX2重組慢病毒感染骨髓間充質(zhì)干細胞，使其高表達RUNX2基因，可以使OCN、OSTEONECTIN、ALP、BMP2、OPN基因表達增強，說明RUNX2基因可以促進骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨方向分化。

簡介：目前全國患乙肝與乙肝病毒攜帶者人數(shù)有2億人多且患者常導(dǎo)致肝硬化和肝癌。而目前臨床上又缺乏真正的制劑故有必要尋找新藥。荔枝核SEMENLITCHI是一種中藥為無患子科植物荔枝的干燥成熟種子性溫、味甘、微苦、歸肝、腎經(jīng)功效行氣散節(jié)、祛寒止痛。藥理研究表明荔枝核水提取物是一種能使HBSAG轉(zhuǎn)陰且僅次于夏枯草的高效抑制HBSAG的藥物。目前國內(nèi)外對荔枝核水溶性化學(xué)成分研究較少并且未見有抗乙肝病毒確切有效成分的報道。因此本課題的研究旨在從荔枝核中分出抗乙肝病毒有效部位甚至有效成分。本課題的研究內(nèi)容如下1從荔枝核50％乙醇總提取物B的水溶部分出發(fā)經(jīng)D101型大孔吸附樹脂吸附、洗脫等分離手段最終得C、D、E、F部位。應(yīng)用HEPG2215細胞系檢測這幾個部位對HBSAG和HBEAG的抑制作用。結(jié)果表明E的抑制作用非常顯著在不影響細胞正常生長的藥物濃度200ΜGML1下于實驗第九天對HBSAG和HBEAG的抑制率分別為909和843。2從從抗乙肝病毒有效部位E出發(fā)經(jīng)聚酰胺柱層析分離得四個部位H、I、J、K應(yīng)用HEPG2215細胞系檢測出I和J的抑制HBV作用非常顯著。在不影響細胞正常生長的藥物濃度800ΜGML1下于實驗第六天對HBSAG和HBEAG的抑制率I為901和834J為868和818。3進一步從I和J部位出發(fā)利用硅膠柱層析、薄層制備、高壓液相色譜制備分離得4個單體測試了其中3個。根據(jù)其IR、FABMS、1HNMR、13CNMR數(shù)值鑒定了其中2個化合物分別為原花色素A1和原花色素A2。這兩個化合物均從荔枝核中首次分離得到其中原花色素A1是從該屬植物中首次得到。

簡介：目的本研究旨在調(diào)查冠心病患者性知識的認知現(xiàn)狀及對性健康教育的需求程度，分析造成目前這種現(xiàn)狀的原因，以期為護士對冠心病患者性生活方面的健康教育提供參考和借鑒，幫助病人樹立正確的性觀念，盡早恢復(fù)理想的性生活。方法本研究以浙江大學(xué)附屬邵逸夫醫(yī)院心內(nèi)科A區(qū)、B區(qū)的冠心病患者為研究對象，采用自設(shè)問卷進行調(diào)查。問卷經(jīng)過測定具有較高的信度、效度，所得數(shù)據(jù)采用SPSS190統(tǒng)計軟件進行分析，統(tǒng)計方法包括描述性統(tǒng)計分析、獨立樣本T檢驗、方差分析、及非參數(shù)檢驗。結(jié)果1有78名冠心病患者同意接受調(diào)查并填寫了問卷，回收問卷78份，有效問卷75份，有效回收率96％。2冠心病患者性知識的總得分為852±279525分，各條目的得分為165183。不同性別、文化程度、職業(yè)、月收入得分有統(tǒng)計學(xué)意義P005。3調(diào)查對象的需求總得分2947±6401040分，調(diào)查對象最想知道的是“過性生活的危險程度”和“過性生活時的注意事項”。排在并列第二的是“何時恢復(fù)性生活”和“在什么情況下禁忌過性生活”。不同性別、年齡、文化程度、職業(yè)得分有差異P005。497％的冠心病患者認為有必要接受性健康教育；72％的患者不愿意向醫(yī)務(wù)人員咨詢性生活方面的知識。685％的患者認為最好的教育方式是健康教育手冊。結(jié)論1冠心病患者對性知識的總體認知水平是非常低的，而女性、低學(xué)歷、低收入及農(nóng)民、商業(yè)服務(wù)業(yè)人員更低。2大部分的冠心病患者都很想了解這方面的知識，說明他們對性健康教育存在著需求，其中又以男性、年輕人、高學(xué)歷、農(nóng)民及商業(yè)服務(wù)業(yè)人員需求較高。3冠心病患者大都不愿意主動去咨詢醫(yī)務(wù)人員，也很少有醫(yī)務(wù)人員主動為患者進行性健康教育。4健康教育手冊被認為是最佳的教育方式。

簡介：人細小病毒B19（HUMANPARVOVIRUSB19，又稱人微小病毒B19，簡稱B19病毒）是迄今發(fā)現(xiàn)的能感染人類的最小的單鏈線狀DNA病毒之一。自1990年我們在國內(nèi)首次證實我國存在B19病毒感染以來，越來越多的研究揭示我國B19病毒感染可誘發(fā)急性再障危象、急性血小板減少性紫癜及孕婦非免疫性流產(chǎn)等疾病，尤其對于免疫功能低下或缺陷患者，因缺乏有效治療藥物，B19病毒持續(xù)感染可致慢性貧血，甚至危及生命。因此，在我國乃至世界都需要建立有效的B19病毒防治體系。B19病毒基因存在較大的變異。目前B19病毒分為三種基因型1型原型、2型類A6和LALI、3型V9。不同基因型的分布存在著地理的差異。歐美等西方國家流行的病毒株大多屬于1型，2、3型少見；3型多見于西非。此三型其DNA序列差異約為10％，其中大于20％序列差異位于P6啟動子區(qū)域。在編碼VP1VP2蛋白的開放閱讀框內(nèi)，2、3型與1型比較，DNA序列變異分別為9％、12％，但氨基酸變異僅為11％、14％。我們在國家自然科學(xué)基金課題（39870021）的資助下，采用基因克隆測序技術(shù)，對收集到的中國大陸B(tài)19病毒流行株（XA株）進行基因分析，發(fā)現(xiàn)我國B19病毒流行株的VP1基因獨特區(qū)有明顯的變異，其基因組一級結(jié)構(gòu)的差異，導(dǎo)致所編碼氨基酸的改變，可能影響到B19病毒抗原位點及免疫特性的變化。B19病毒基因的變異可導(dǎo)致病毒毒力、致病機制的改變。VP1基因表達的蛋白與病毒的免疫原性及機體感染后產(chǎn)生保護性抗體密切相關(guān)，為建立我國B19病毒感染的防治技術(shù)，必須深入研究我國病毒流行株變異基因區(qū)表達的蛋白的結(jié)構(gòu)和功能位點的變化。因此本實驗通過在原核及真核系統(tǒng)表達B19XA2株VP1蛋白，研究其空間結(jié)構(gòu)和功能位點的變化及其變化對抗原性的影響，以揭示變異的VP1基因表達蛋白的生物學(xué)活性，促進B19病毒分子流行病學(xué)、致病機理及預(yù)防疫苗的研究。研究目的本實驗?zāi)康脑谟跀U增獲得B19XA2VP1基因全長，構(gòu)建其原核表達載體，表達融合蛋白。同時構(gòu)建VP1穿梭載體，在昆蟲細胞SF9中表達VP1蛋白，并以原核及真核表達蛋白為免疫原，免疫動物，制備具有一定敏感性和特異性的抗VP1蛋白的多克隆抗血清，用于檢測VP1蛋白的免疫原性。分別以原核及真核表達蛋白為抗原，采用ELISA方法與臨床患兒的血清反應(yīng)，并與德國PARVOVIRUSB19IGMELISAKIT檢測結(jié)果比較，分析表達產(chǎn)物VP1蛋白的反應(yīng)原性，從而為以后研究VP1蛋白的生物學(xué)功能，和B19病毒的防治奠定基礎(chǔ)。實驗方法1獲得目的基因自行設(shè)計引物，按巢式PCR篩選陽性B19感染標(biāo)本，自陽性標(biāo)本中按照常規(guī)PCR方法擴增獲得長度為2345BP的HPVB19VP1全長基因（NT2623NT4968）。2原核表達重組蛋白將VP1基因克隆入載體PET28A，構(gòu)建原核重組表達載體VP1PET28A，并在ECOLIBL21DE3中擴增，通過IPTG誘導(dǎo)表達VP1融合蛋白，SDSPAGE和WESTERNBLOT技術(shù)分析蛋白表達情況及初步鑒定表達蛋白。3真核表達VP1蛋白將VP1基因及載體PFASTBAC1雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化入DH10BAC，用抗生素及藍白斑表型篩選陽性重組體，PCR鑒定，獲得含目的基因的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒VP1BAC，用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將陽性重組體轉(zhuǎn)入SF9細胞，擴增病毒，循環(huán)凍融和裂解，超速離心，獲溶解的蛋白質(zhì)上清。4以原核及真核表達的重組蛋白為抗原，免疫家兔，制備抗VP1蛋白的多克隆抗血清，ELISA法檢測抗體效價；用重組菌超聲裂解上清及轉(zhuǎn)染后SF9細胞裂解后上清（均含重組VP1蛋白）包被ELISA板，分別與臨床患兒的血清反應(yīng)，并與德國ELISA試劑盒檢測結(jié)果比較，分析表達產(chǎn)物VP1蛋白的反應(yīng)原性。實驗結(jié)果1巢式PCR篩選到2份陽性B19感染標(biāo)本，按照常規(guī)PCR方法擴增此2份標(biāo)本，自其中1份標(biāo)本獲得B19VP1全長基因（2345BP），將其命名為B19XA2株。2原核表達載體VPLPET28A經(jīng)SALⅠ和XBAⅠ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳觀察酶切片段分子量與預(yù)期結(jié)果相符（2345BP），測序結(jié)果證實序列完全正確。3將重組菌VP1PET28ABL21DE3經(jīng)誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)，可表達分子量約為87KDA的蛋白，經(jīng)WESTERNBLOT鑒定，可與6HIS抗體結(jié)合，證實為VP1融合蛋白。4構(gòu)建穿梭載體VP1BAC，通過抗生素及藍白斑表型雙重篩選陽性重組體，經(jīng)PCR鑒定，獲得含目的基因的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒VP1BAC，用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將陽性重組體轉(zhuǎn)入SF9細胞，細胞出現(xiàn)典型病變，收集病變細胞，裂解后SDSPAGE顯示有分子量87KDA的蛋白表達，與預(yù)期分子量一致。5ELISA檢測原核系統(tǒng)表達蛋白刺激后產(chǎn)生抗VP1多克隆抗體效價可達112800。真核系統(tǒng)表達蛋白刺激后產(chǎn)生抗體效價可達150000。6以重組桿狀病毒表達的VP1蛋白作抗原，與B19病毒陽性血清有反應(yīng)，其OD值略低于德國ELISA試劑盒檢測結(jié)果。而大腸桿菌系統(tǒng)表達的重組VP1蛋白作為抗原，與B19病毒感染后陽性血清無反應(yīng)。結(jié)論1成功構(gòu)建了重組人細小病毒B19XA2株VP1全長基因的ECOLIVP1PET28ABL21DE3。2成功構(gòu)建了人細小病毒B19XA2株VPL全長基因重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒VP1BAC，并在昆蟲細胞SF9中成功表達VP1蛋白。3兩種表達系統(tǒng)表達的重組VP1蛋白作為抗原有誘導(dǎo)特異性抗體產(chǎn)生的能力，即具有良好的免疫原性。4BACTOBAC系統(tǒng)表達的VP1蛋白其生物活性更接近天然產(chǎn)物，可用作抗原檢測人感染B19病毒后的血清抗體，且與進口試劑盒進行平行比較，初步達到同類試劑盒水平。

簡介：目的本研究擬用化學(xué)交聯(lián)方法構(gòu)建一種兔人嵌合型戊型肝炎病毒HEPATITISEVIRUS，HEVIGM抗體作為抗HEVIGM檢測質(zhì)控物。方法基因重組蛋白NE2作為抗原免疫家兔，獲得兔抗HEVIGG，酶免方法檢測其滴度和活性后，蛋白A親合層析純化IGG，十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳SODIUMDODECYLSULFATEPOLYACRYLAEGELELECTROPHESIS，SDSPAGE分析IGG純度，紫外分光光度計測定260280NM吸光度并計算抗體濃度。EDC1ETHYL33DILHYLAMINOPROPYLCARBODIIEHYDROCHLIDE，1乙基33二甲基氨基丙基碳二亞胺交聯(lián)兔抗HEVIGG與人IGM。抗HEVIGM酶聯(lián)免疫測定ENZYMELINKEDIMMUNOSBENTASTRAYELISA試劑盒同時檢測嵌合抗體和陽性血清，并比較兩者滴度。嵌合抗體稀釋后，放置于不同溫度條件下，保存不同時間后，ELISA檢測穩(wěn)定件。結(jié)果未純化的兔抗HEVIGG滴度為1100，000，純化后，SDSPAGE電泳結(jié)果顯示輕鏈和重鏈兩條帶25KD和50KD，沒有雜帶，達到電泳純，抗體濃度達10MGML。嵌合抗體與人抗HEVIGM陽性血清滴度均為1160，說明其同抗原的親和性與真實的人類樣本相似。穩(wěn)定性實驗表明，此嵌合抗體在室溫、4℃可至少保存兩個月，而在較低溫度如20℃、70℃和反復(fù)凍融條件下不穩(wěn)定。結(jié)論本研究用化學(xué)交聯(lián)方法成功構(gòu)建了抗HEVIGM嵌合抗體質(zhì)控物，在國內(nèi)外尚屬首次，其克服了傳統(tǒng)血清質(zhì)控物的缺點，根據(jù)已建立起的方法，可以構(gòu)建一系列應(yīng)用于免疫測定檢測不同病毒特異IGM抗體的陽性質(zhì)控物。

簡介：山西大學(xué)2012屆碩士學(xué)位論文“記憶“作為社會行為的哲學(xué)分析巴特萊特認知思想研究作者姓名指導(dǎo)教師學(xué)科專業(yè)研究方向培養(yǎng)單位學(xué)習(xí)年限周振華魏屹東教授外國哲學(xué)認知哲學(xué)哲學(xué)社會學(xué)學(xué)院2009年9月至2012年6月二O一二年五月㈣炒目錄～中文摘要IABSTRACTIII引言1與I吾L第一章“記憶”研究的思想基礎(chǔ)311艾賓浩斯為代表的古典聯(lián)想主義312巴特萊特為代表的反聯(lián)想主義513巴特菜特記憶研究的傳承與發(fā)展7第二章“記憶”研究的主要方法與內(nèi)容1021記憶研究的四種主要方法10211描述的方法10212象形文字方法10213重復(fù)再現(xiàn)的方法11214系列再現(xiàn)的方法1122“記憶”的相關(guān)實驗與社會考察1223記憶作為社會行為的意義15第三章“記憶“研究的哲學(xué)意義2L31記憶的預(yù)設(shè)作為對象的記憶如何存在2232記憶的心靈表征詞語、意象和思維的關(guān)系2433記憶的意義研究語境演變的社會性考察26結(jié)語31主要參考文獻32攻讀學(xué)位期間取得的研究成果34致謝35個人簡況及聯(lián)系方式36承諾書37學(xué)位論文使用授權(quán)聲明38

簡介：南京師范大學(xué)博士學(xué)位論文關(guān)于說謊的道德認知研究姓名邵愛國申請學(xué)位級別博士專業(yè)基礎(chǔ)心理學(xué)指導(dǎo)教師朱永新20070528ABSTRACTCONCEPTSANDRESEARCHLITERATURESONLYINGWERESYSTEMATICALLYANALYZEDINTHISDISSERTATIONBASEDONTHEMODELOFMORALPSYCHOLOGICALPROCESSBROUGHTBYRESTJ，THREERESEARCHESONMORALCOGNITIONFORLYINGOFCHINESEWE∞PERFORMEDINTHEFIRSTRESEARCKATTRIBUTESOFMORALJUDGMENTFORLYINGWEREANALYZEDBYARANDOMIZEDBLOCKDESIGNWITHSINGLEINDEPENDENTVARIABLETHERESULTREVEALSTHAT25T∞TSESONLYINGARECLASSIFIEDINTO2GROUPSBYCLUSTERANALYSISBASEDONSCORESOFMORALJUDGMENTFORLYM晷11LEDIFFERENCEBETMEENMEALSCORESOFTHETWOGROUPSOFMORALJUDGMENTFORLYINGISSIGNIFICANTINSTATISTICSPARTICIPANTSTENDTOTHINKTHATMORALVALUEFORLYINGINTHEFIRSTGROUPMWHICHLIARS01FTELLDOGOODTOOTHERSISPOSITIVEBUTTHEONEINTHESECONDGROUPINWHICHLIARSOFTENDOHARMTOOTHERSBUTBENEFITTHEMSELVESISNFGATIVETHEFOLLOWINGCONCLUSIONSAREFOUNDONLYINGWITHPOSITIVEM啪LVALUE1PARTICIPANTSARCAPTTOMAKEPOSITIVEMORALVALUATIONIFTHEYA∞ONTHESIDEOFLIARS2MENAREMORELIKELYTOMAKEPOSITIVEMORALVALUATIONTHANWOMAN3TEACHERSTENDTOMAKENEGATIVEMORALVALUATION3ELDERPARTICIPANTSAREMORELIKELYTOMAKENEGATIVEMORALVALUATIONTHANTHEYOUNGTHEFOLLOWINGCONCLUSIONSA托FOUND01“1LYINGWITHNEGATIVEMORALVALUE1PARTICIPANTSAREAPTTOMAKEPOSITIVEMORALVALUATIONIFTHEYAREONTHESIDEOFLJARS2PARTICIPANTSWITHUNDERGRADUATECOURSOEDUCATIONAREMORELIKELYTOMAKEPOSITIVEMORALVALUATIONTHALLTHOSEWITHOTHEREDUCATIONBACKGROUNDR3STUDENTPARTICIPANTSAREMORELIKELYTOMAKEPOSITIVEMORALVALUATIONTHANTHEOTHERSINCLUDINGTEACHERS4PARTICIPANTSFROM31TO41ALEMORELIKELYTOMAKENEGATIVEMORALVALUATIONTHANTHOSEFROM15TO30INTHESECONDRESCARCLLATTRIBUTESOFMORALCHOICEFORLYINGWEREANALYZEDBYARANDOMIZEDBLOCKDESIGNWITHTHREEINDEPENDENTVARIABLES2X2X4INTHISRESEARCILTHEIMPORTANCEOFVALUESABOUTSUBSISTENCE，SAFETYLIBERTYPRIVACYVOCATION，LOVE，F(xiàn)RIENDSHIPFACE，REPUTATION，WEALTHANDJUSTICEISRESPECTIVELYCOMPAREDWITHVALUEOFTHETRUTHFOLNEASITISFOUNDINTHERESEARCHTHATVALUEOFTRUTHFULNESSISNOTTHEMOSTIMPORTANTTHEREAREMANYMOREIMPORTANTVALUESTHANTRUTHFOLNESS11忙VALUEOFTRUTHFUINESSISCONCLUDEDINELEVENCA蹦3WHICHARECLASSIFIEDINTO3GROUPSBYCLUSTERANALYSISBASEDONSCORESOFMORALCHOICEFORLYINGPARTICIPANTSAREAPTTOCHOOSE‘‘LYING’’FORSUBSISTENCESAFETYLIBERTYPRIVACYVOCATIONSOMENOTICEABLECONCLUSIONSAREDRAWNINTHERESEARCH1PARTICIPANTSAREAPTTOCHOOSE“LYING’FORTHEIROWNVALUESOFSUBSISTENCE，SAFETYORLIBERTYTHANFOROTHERSBUTAPTTOCHOOSE“LYING“FORVALUESOFOTHERSSUCH∞REPUTATIONLOVEANDJUSTICE2PARTICIPANTSAREMORELIKELYTOSAVEBENEFITSTHANTOGAINBENEFITSBYCHOOSING“LYING”FORPRIVACYWEALTH，LOVE，ORREPUTATION3PARTICIPANTSAREMORELIKELYTOCHOOSE“LYING’INOCCASIONSWITHHIGHRISKTHANTHOSEWITHLOWRISKINTHELASTRESEARCH，AMORALCHOICEMODELONLYINGWASESTABLISHEDBYAMNDOMIZEDBLOCKDESIGNWITHTHREEINDEPENDENTVARIABLES6X3X2THECONTEXTOFLYINGX，RELATIONBETWEENLIARANDRECEIVERX2，RELIABILITYOFLIES4，MORALVALUEFORLYINGXS，POSSIBILITYOFBEINGFORGIVENESSX6POSSIBILITYOFLOSSOFTRUSTX7ALLHAVESOMESIGNIFICANTEFFECTSONMORALCHOICEFORLYINGKEYWORDLYING；DEOEPTIENIIES；NORAIOOGNITION；MORALJUDGEMENTILORAIOHOIOE

簡介：數(shù)字認知是數(shù)學(xué)認知研究領(lǐng)域的一個核心問題，了解兒童數(shù)字認知的特征及神經(jīng)機制，有助于科學(xué)地認識和發(fā)展兒童的數(shù)學(xué)能力。本研究采用視覺事件相關(guān)電位技術(shù)，對兒童數(shù)字認知的加工特征進行了探討。被試為16名小學(xué)45年級的學(xué)生，刺激材料選用阿拉伯?dāng)?shù)字和點陣數(shù)字。實驗任務(wù)分為兩個，實驗一要求被試判斷從1到9除5的阿拉伯?dāng)?shù)字或點陣數(shù)字的數(shù)量是大于還是小于55點，目的在于考察兒童數(shù)量認知的特征；實驗二要求被試判斷從1到9除5的阿拉伯?dāng)?shù)字或點陣數(shù)字的數(shù)序是排列在55點的前面還是后面，以考察兒童數(shù)序認知的發(fā)展?fàn)顩r。實驗結(jié)果如下1數(shù)量大小判斷任務(wù)中在早期知覺加工階段，阿拉伯?dāng)?shù)字的P1波幅大于點陣數(shù)字，而點陣數(shù)字N1的波幅則大于阿拉伯?dāng)?shù)字，但兩類刺激的P1和N1的潛伏期均不存在差異。在語義表征階段，阿拉伯?dāng)?shù)字的P2波幅大于點陣數(shù)字，潛伏期小于點陣數(shù)字。2數(shù)序前后判斷任務(wù)中在早期知覺加工階段，阿拉伯?dāng)?shù)字P1的波幅大于點陣數(shù)字，而點陣數(shù)字N1的波幅則大于阿拉伯?dāng)?shù)字，但兩類刺激的P1和N1的潛伏期均不存在差異。在語義表征階段，兩類材料之間不存在差異。3不論是在數(shù)量大小判斷還是數(shù)序前后判斷任務(wù)下，在早期加工階段，阿拉伯?dāng)?shù)字與點陣數(shù)字之間表現(xiàn)出相似的認知特征，但在語義表征階段不存在這種現(xiàn)象。

簡介：蘇州大學(xué)學(xué)位論文獨創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明所提交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨立進行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不含其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不含為獲得蘇州大學(xué)或其它教育機構(gòu)的學(xué)位證書而使用過的材料。對本文的研究作出重要貢獻的個人和集體，‘均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人承擔(dān)本聲明的法律責(zé)任。論文作者簽名蘭匿日期2。，1S、弓蘇州大學(xué)學(xué)位論文使用授權(quán)聲明ILUQLMNLLLQLLLLIHILLLLLLLLLLLLIY2121114本人完全了解蘇州大學(xué)關(guān)于收集、保存和使用學(xué)位論文的規(guī)定，即學(xué)位論文著作權(quán)歸屬蘇州大學(xué)。本學(xué)位論文電子文檔的內(nèi)容和紙質(zhì)論文的內(nèi)容相一致。蘇州大學(xué)有權(quán)向國家圖書館、中國社科院文獻信息情報中心、中國科學(xué)技術(shù)信息研究所含萬方數(shù)據(jù)電子出版社、中國學(xué)術(shù)期刊光盤版電子雜志社送交本學(xué)位論文的復(fù)印件和電子文檔，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存和匯編學(xué)位論文，可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索。涉密論文口本學(xué)位論文屬在年月解密后適用本規(guī)定。非涉密論文曰論文作者簽名拳廷芋日期20，≥歲、多論文作者簽名／蘆心下日期2，厶幾導(dǎo)師簽名日期EI矽／2R歲

簡介：呼吸道合胞病毒RESPIRATYSYNCYTIALVIRUSRSV主要引起嬰幼兒毛細支氣管炎和肺炎是嬰兒和兒童呼吸道疾病中的最常見的病原體之一本實驗在觀察了RSV感染誘導(dǎo)A549細胞凋亡后進一步探討病毒唑?qū)SV誘導(dǎo)A549細胞及對相關(guān)基因表達調(diào)控的影響結(jié)論1、RSV感染后期能誘導(dǎo)A549細胞凋亡促凋亡基因FASL、FAS、BAX和抗凋亡基因BCL2、SURVIVIN表達水平的差異是RSV誘導(dǎo)凋亡的機制之一2、在病毒唑發(fā)揮抗RSV的作用過程中主要通過上調(diào)SURVIVIN基因和下調(diào)BAX的表達來抑制RSV感染誘導(dǎo)A549細胞發(fā)生凋亡3、首次報道了SURVIVIN基因在RSV誘導(dǎo)凋亡中的作用發(fā)現(xiàn)SURVIVIN基因的表達在RSV感染組呈遞減狀態(tài)在治療組呈遞增狀態(tài)

簡介：近年來，心理學(xué)家對遺忘的研究越來越感興趣，尤其是關(guān)于定向遺忘的研究，已經(jīng)成了研究的一個熱點。定向遺忘是指遺忘的有意性和指向性。定向遺忘是人類的一種重要的機能。忘記過時的信息或痛苦的事件對個體的身心健康具有十分重要的作用。有意遺忘的研究范式與自然遺忘的研究范式有所不同，是有關(guān)記憶研究的另一種范式。本研究設(shè)計了兩個實驗，試圖通過兩個實驗來對定向遺忘的認知機制進行一定的探討。實驗一，從實驗材料，實驗材料自身的性質(zhì)以及對實驗材料的不同的加工程度等方面來加以考慮，試圖探討不同類型的詞匯以及同一詞匯的不同性質(zhì)在不同的加工深度下對定向遺忘會產(chǎn)生的什么樣的影響。實驗二將干擾信息這一因素加以引入，并與對實驗材料的不同加工程度相結(jié)合，主要是試圖探討干擾信息會對定向遺忘現(xiàn)象產(chǎn)生什么樣的影響。通過對實驗結(jié)果進行分析，得出以下幾個結(jié)論1定向遺忘的產(chǎn)生是由多種原因?qū)е碌?，不能單純的僅僅運用某種理論來進行解釋，其產(chǎn)生可能是個體對記憶項的選擇性復(fù)述與對遺忘項的抑制共同作用的結(jié)果。并且個體對遺忘項的抑制可能并不僅僅是發(fā)生在提取階段，個體可能在學(xué)習(xí)階段就對要求遺忘的項目的進行了注意的抑制，而且定向遺忘中的抑制主要是一種處于意識狀態(tài)之下的主動抑制。2定向遺忘受實驗材料的類型的影響，實驗材料不同對定向遺忘所產(chǎn)生的影響就不同，并且定向遺忘受實驗材料本身所具有的不同性質(zhì)的影響。3加工水平對定向遺忘也是有影響的，并且加工水平對定向遺忘產(chǎn)生的影響與實驗材料的類型是有一定的關(guān)系的，實驗材料不同其所產(chǎn)生的影響就不一樣。并且對某些實驗材料而言，其加工水平可能會受到定向遺忘的指導(dǎo)語的影響。4干擾信息對定向遺忘也是有影響的。干擾信息對記憶項的影響并不大，但是對遺忘項的影響卻是明顯的，在定向遺忘的研究中，干擾信息對記憶效果的影響主要受定向遺忘的指導(dǎo)語的影響，而受加工水平的影響卻不大。在定向遺忘的研究范式中加工水平雖然可能受干擾信息的影響，但是這種影響并不起多大的作用。

簡介：為進一步闡明L1基因表達的分子調(diào)控機制，我們利用不同分化階段的小鼠和人的原代角質(zhì)細胞培養(yǎng)系統(tǒng)和角質(zhì)細胞體外翻譯系統(tǒng)，研究野生型和優(yōu)化型的HPV6BL1基因隨細胞分化的不同轉(zhuǎn)錄和翻譯特點，試圖進一步解析影響L1蛋白在角質(zhì)細胞中表達的分子調(diào)控機制。一、HPV58L1MRNA在優(yōu)化的酵母體外翻譯系統(tǒng)中的表達研究研究中首先以含有HPV58全基因組的質(zhì)粒PLINK322HPV58為模板，PCR法擴增HPV58全長型L1基因LL1和截短型L1基因SL1并連接到真核表達載體PCDNA30上，構(gòu)建出真核重組質(zhì)粒PCDNA3LL1、PCDNA3SL1，經(jīng)酶切和測序鑒定序列無誤。進而利用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒將PCDNA3LL1、PCDNA3SL1中的L1基因體外轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)的長短L1MRNA備用。為構(gòu)建酵母體外翻譯系統(tǒng)，我們首先制備了酵母的原生質(zhì)體，然后根據(jù)以往報道方法制備啤酒酵母細胞的裂解物，并對制備過程進行了調(diào)整和改良。考慮到裂解緩沖液中的鎂離子，鉀離子濃度會影響外源性MRNA翻譯活性，我們針對HPV58L1MRNA在酵母體外翻譯系統(tǒng)中的翻譯條件需求對鎂離子和鉀離子濃度進行了優(yōu)化。為檢測蔗糖對酵母裂解物穩(wěn)定性的影響，我們在裂解物的制備過程中分別加入不同濃度的蔗糖，并檢測其對系統(tǒng)的保護作用。為確定系統(tǒng)優(yōu)化后翻譯效率的提高程度，檢測了優(yōu)化前后酵母系統(tǒng)對HPV58SL1的翻譯效率，并比較了與商品化的兔網(wǎng)織紅細胞體外翻譯系統(tǒng)RRL的翻譯效率的差異，已知劑量的HPV6BL1蛋白作為信號強度對照。結(jié)果顯示，我們構(gòu)建的體外翻譯系統(tǒng)對HPV58L1MRNA翻譯活性良好。鎂離子和鉀離子對L1蛋白翻譯的影響顯著，鎂離子在裂解緩沖液中濃度為22MM時系統(tǒng)翻譯活性最高，鉀離子的最佳濃度為220MM。加入蔗糖后裂解物的抗凍融能力都有較大的提高，蔗糖的最佳濃度為100MM。對酵母體外翻譯系統(tǒng)進行優(yōu)化后，HPV58SL1MRNA的翻譯效率比RRL系統(tǒng)高出2倍。經(jīng)計算，優(yōu)化前1ΜGSL1MRNA在1毫升反應(yīng)液中蛋白的產(chǎn)量為2040ΜG，優(yōu)化后為5070ΜG，產(chǎn)量提高了1倍。為進一步研究HPV58長短L1MRNA在該系統(tǒng)中的翻譯特點和差異，我們在優(yōu)化的酵母體外翻譯系統(tǒng)中加入HPV58全長和截短型L1MRNA，分別進行體外翻譯反應(yīng)。反應(yīng)過程中改變反應(yīng)時間、L1MRNA模板量，加入外源性氨基酸或亮氨酸和酵母的氨基酰TRNA等，觀察其對長短L1蛋白合成的影響。結(jié)果顯示HPV58長短L1MRNA均可以在酵母系統(tǒng)中獲得良好的表達。對比兩者的翻譯模式，截短型L1翻譯啟動迅速，10分鐘內(nèi)即達最高表達量；全長型L1翻譯啟動較慢，反應(yīng)30分鐘后表達量與截短型持平。提示全長型L1蛋白的翻譯依賴于反應(yīng)時間，而截短型L1則不明顯。隨初始MRNA模板量的增高，兩種L1蛋白信號均明顯增強，但截短型L1MRNA翻譯水平仍明顯高于全長型L1MRNA。外源性的氨基酸的加入僅可以顯著提高全長型L1蛋白的翻譯，而對截短型L1蛋白的翻譯沒有影響，提示內(nèi)源性的氨基酸無法滿足全長L1蛋白合成的需要。加入外源性酵母AATRNA對兩種L1蛋白的翻譯均無明顯影響，提示系統(tǒng)中內(nèi)源性的TRNA可充分滿足HPV58兩種L1MRNA的表達。為進一步揭示長短L1蛋白合成效率的差異原因，我們在反應(yīng)系統(tǒng)中加入不同濃度的外源性的亮氨酸，觀察其對兩種L1蛋白合成的影響。為檢測體外合成的L1蛋白是否可以組成VLP顆粒，將體外翻譯的反應(yīng)液直接進行蔗糖超速離心后透射電鏡檢測VLP顆粒的形成。WESTERNBLOT結(jié)果顯示，亮氨酸可以提高全長型的L1MRNA的翻譯水平，且效應(yīng)呈亮氨酸劑量依賴性；而截短型L1翻譯不受影響。實驗結(jié)果表明，系統(tǒng)中亮氨酸的缺乏是限制HPV58全長型L1表達的重要因素，這是由于長L1蛋白起始序列中亮氨酸的高頻率使用所導(dǎo)致。電鏡結(jié)果顯示全長和截短型L1蛋白均可以組裝成VLP顆粒。綜上所述，本部分中我們成功地構(gòu)建了一種新型的適合HPV58L1蛋白合成的酵母無細胞翻譯系統(tǒng)。通過對HPV58L1蛋白合成所需的各成分濃度進行優(yōu)化，顯著提高了系統(tǒng)對L1MRNA的翻譯效率，經(jīng)優(yōu)化后首次觀察到了系統(tǒng)中HPV58VLP的形成。因而該系統(tǒng)成為繼RRL系統(tǒng)后的第二個可進行HPVL1病毒樣顆粒組裝的體外翻譯系統(tǒng)。我們進一步利用該系統(tǒng)探索并揭示了導(dǎo)致長短L1MRNA翻譯差異的原因，并首次觀察到了HPV58長短L1蛋白組裝的VLP顆粒。HPV酵母體外翻譯系統(tǒng)具有的開放性和高度可操作性等獨特優(yōu)勢，因而該系統(tǒng)有望用于1研究HPV58L1蛋白在酵母中表達的影響因素，為提高L1蛋白表達產(chǎn)量、完善VLP酵母基因工程疫苗的生產(chǎn)、開發(fā)提供重要的借鑒；2探討HPVVLP組裝的分子機制，為提高酵母中VLP形成效率，減少其與天然病毒顆粒的免疫原性差異等研究提供一個方便快捷的工具；3研究HPVDNA包裝的分子機制，為今后探討長短L1蛋白包裝的病毒顆粒的感染力和感染機制的差異以及抗病毒新靶點的篩選等研究提供良好的平臺。目前，研究成果已申請國家發(fā)明專利一項公示期。同類研究尚未見報道。二、HPV6BL1基因在原代角質(zhì)細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的表達研究為了檢測基因密碼組成對L1基因在持續(xù)分化的角質(zhì)細胞中表達的影響，我們用HPV6B野生型和優(yōu)化型的L1真核表達質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染培養(yǎng)一天的鼠角質(zhì)細胞。轉(zhuǎn)染后的D3，D6，D9，D12分別收集鼠角質(zhì)細胞提取RNA和蛋白。對細胞固定后進行免疫熒光染色后鏡下觀察。實時熒光定量PCR檢測提取的RNA樣品中L1基因的轉(zhuǎn)錄水平。WESTERNBLOT方法檢測L1蛋白的合成情況。鏡下顯示隨著轉(zhuǎn)染時間的增長，細胞顯示出明顯的逐步增強的細胞分化特征，免疫熒光染色結(jié)果也顯示，角質(zhì)細胞終末分化的標(biāo)志性蛋白外皮蛋白INVOLUCRIN在細胞內(nèi)的表達也隨轉(zhuǎn)染時間的延長而明顯增強。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后角質(zhì)細胞可以持續(xù)轉(zhuǎn)錄野生和優(yōu)化型的L1MRNA至少12天，而且優(yōu)化型的L1MRNA的水平始終顯著高于野生型L1，這表明對GC結(jié)尾的密碼子進行優(yōu)化可以促進L1基因在KC細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄。隨著細胞的分化，野生型和優(yōu)化型的L1基因的轉(zhuǎn)錄水平都顯著下降。WESTERNBLOT分析顯示，野生型L1蛋白的表達隨著細胞轉(zhuǎn)染時間的延長而增強；優(yōu)化型L1蛋白水平隨著細胞轉(zhuǎn)染時間的延長而降低。這表明L1MRNA的密碼子成分組成是調(diào)節(jié)L1蛋白在KC細胞內(nèi)持續(xù)表達的一個重要因素；HPVL1蛋白的表達是轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)，同時與細胞的分化水平顯著相關(guān)。甲硫氨酸標(biāo)記的L1蛋白免疫共沉淀實驗顯示，檢測到的L1蛋白的持續(xù)表達是由于L1蛋白的持續(xù)合成，LLMRNA的密碼子組成是決定L1蛋白持續(xù)性合成的重要因素?？紤]到人角質(zhì)細胞是HPV感染的天然宿主細胞，我們檢測了HPV6BL1真核表達質(zhì)粒在原代人角質(zhì)細胞內(nèi)的表達情況。所得結(jié)果與鼠角質(zhì)細胞中的結(jié)果相似。為了進一步證實TRNA對L1的翻譯調(diào)控作用，我們檢測了不同分化程度的人或鼠KC中分離的AATRNA對體外翻譯系統(tǒng)中L1蛋白翻譯的影響。結(jié)果表明，野生型L1MRNA傾向于在分化的鼠KC細胞制備的裂解物中進行翻譯，而優(yōu)化型L1MRNA傾向于在低級分化的鼠KC細胞制備的裂解物中進行翻譯。這一結(jié)果與L1轉(zhuǎn)染的KC細胞中觀察到的野生和優(yōu)化L1蛋白的表達模式相同。這表明低級分化和完全分化的角質(zhì)細胞中的AATRNA組成不同，因而可以不同程度的吻合HPV野生和優(yōu)化型的L1MRNA翻譯的需要，從而可以調(diào)節(jié)它們在體外的翻譯水平。綜上所述，本研究中我們首次利用不同分化階段的人和鼠原代角質(zhì)細胞培養(yǎng)系統(tǒng)和體外翻譯系統(tǒng)進行了L1蛋白翻譯調(diào)控機制的研究。研究中首次探索了瞬時轉(zhuǎn)染后的角質(zhì)細胞中L1基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯時限，揭示了同義密碼子的替換效應(yīng)與細胞分化的密切關(guān)系。結(jié)果顯示密碼優(yōu)化可以改變L1基因在細胞內(nèi)的表達時效和表達模式，這種差異主要是由于分化階段不同的角質(zhì)細胞中的TRNA的組成不同，因而可以不同程度的調(diào)節(jié)野生型和優(yōu)化型的L1基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平所致。所得結(jié)果為進一步闡明PVL1基因表達的分子調(diào)控機制提供了重要的實驗數(shù)據(jù)和理論支持，同類研究尚未見報道。