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簡(jiǎn)介：原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究所取得的成果。除文中己經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的科研成果。對(duì)本文的研究作出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均己在文中以明確方式標(biāo)明。本人完全意識(shí)到本聲明的法律責(zé)任由本人承擔(dān)。論文作者簽名單塹止日期砂華沙、，‘關(guān)于學(xué)位論文使用授權(quán)的聲明本人完全了解山東大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留或向國(guó)家有關(guān)部門(mén)或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱本人授權(quán)山東大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存論文和匯編本學(xué)位論文。保密論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定論文作者簽名導(dǎo)師簽名工嘎級(jí)日期WQS山東大學(xué)博士論文兒于出生時(shí)留取臍血檢測(cè)HBVDNA。入選研究的孕婦，均符合2000年全國(guó)肝炎會(huì)議擬定的無(wú)癥狀乙肝病毒攜帶者診斷標(biāo)準(zhǔn)。早產(chǎn)兒、低體重兒、窒息兒及有妊娠期出血史產(chǎn)婦所分娩的新生兒排除本研究。孕婦外周血和新生兒臍血血清中HBVDNA均陽(yáng)性者作為研究組，孕婦外周血HBVDNA陽(yáng)性但新生兒臍血血清中HBVDNA陰性者作為對(duì)照組，用PCR微板核酸雜交一ELISA法行HBV基因分型。所有新生兒于出生后12小時(shí)內(nèi)及第14天各注射乙肝免疫球蛋白HBIG200U，出生24小時(shí)內(nèi)、1月及6月齡共接種3次乙肝疫苗，對(duì)新生兒及嬰兒進(jìn)行前瞻性隨訪研究，由產(chǎn)婦自愿選擇母乳喂養(yǎng)或人工喂養(yǎng)，分別于嬰兒7月及12個(gè)月時(shí)隨訪，檢測(cè)嬰兒外周靜脈血HBVDNA及乙肝血清標(biāo)志物，同時(shí)詢(xún)問(wèn)嬰兒喂養(yǎng)方法，母乳喂養(yǎng)1個(gè)月以上者為母乳喂養(yǎng)組，從未行母乳喂養(yǎng)的為人工喂養(yǎng)組，母乳喂養(yǎng)少于1月者排除本研究。嬰兒7月時(shí)未感染乙肝但抗一HBS陰性者給予乙肝疫苗5119加強(qiáng)注射。結(jié)果1乙肝血清學(xué)標(biāo)志物HBSAGHBEAG及抗一HB。均陽(yáng)性孕婦血清中HBVDNA均陽(yáng)性，陽(yáng)性率為1004949HBSAG與HBEAG陽(yáng)性者HBVDNA陽(yáng)性率亦為100A1616HBSAG及抗一HBC陽(yáng)性者，HBVDNA陽(yáng)性率為54171324HBSAG、抗一HBE及抗一HBC陽(yáng)性者HBVDNA陽(yáng)性率較低，僅為4173N2。單純HBSAG陽(yáng)性和HBSAG及抗一HBE陽(yáng)性孕婦無(wú)1例HBVDNA陽(yáng)性。2HBSAGHBEAG及抗一HBC均陽(yáng)性孕婦所生的新生兒臍血HBVDNA陽(yáng)性率最高，為1837949HBSAG與HBEAG陽(yáng)性及HBSAG與抗一HBC陽(yáng)性者次之，分別為1250216及12503124HBSAG、抗一HBE及抗一HBC陽(yáng)性者為133175。單純HBSAG陽(yáng)性和HBSAG及抗一HBE陽(yáng)性孕婦無(wú)1例新生兒臍血陽(yáng)性。HBSAGHBEAG及抗一HBC均陽(yáng)性孕婦所生的新生兒臍血HBVDNA陽(yáng)性率與HBSAG、抗一HBE及抗一HBC陽(yáng)性者有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義Z29415P0002HBSAG與抗一HBC陽(yáng)性孕婦所生的新生兒臍血HBVDNA陽(yáng)性率與HBSAG、抗一HBE及抗一HBC陽(yáng)性孕婦所生的新生兒臍血HBVDNA陽(yáng)性率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0043其余各組對(duì)比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。315例臍血HBVDNA陽(yáng)性的新生兒11例發(fā)生于HBEAG陽(yáng)性的孕婦，陽(yáng)性率為16921165，僅4例發(fā)生于HBEAG陰性的孕婦，陽(yáng)性率為377O3774106HBEAG陽(yáng)性與HBEAG陰性孕婦所生新生兒臍血HBVDNA陽(yáng)性率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義X28706P0003。

簡(jiǎn)介：該實(shí)驗(yàn)在本室過(guò)去證實(shí)HTNV感染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)HSP70與NP存在形態(tài)共定位和蛋白分子相互結(jié)合的基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究了該感染模型中病毒NP、病毒囊膜糖蛋白G2與HSP70、HSP27及GRP94的相互關(guān)系并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建以HSP70為載體、NP為靶抗原的針對(duì)HFRS的DNA疫苗同時(shí)在原核體系中分析HSP70的表達(dá)條件并誘導(dǎo)其高效表達(dá)該實(shí)驗(yàn)證明HTNV感染后有HSPS病毒蛋白復(fù)合物形成為研究HSPS在病毒感染復(fù)制中的作用以及抗病毒感染方面提供了實(shí)驗(yàn)資料同時(shí)成功構(gòu)建可表達(dá)HSP70核蛋白復(fù)合物的融合真核表達(dá)質(zhì)粒并原核高效表達(dá)了HSP70為針對(duì)HFRS的DNA疫苗的研制打下基礎(chǔ)

簡(jiǎn)介：第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文雙調(diào)控減毒增殖腺病毒CNHK500治療肝癌的實(shí)驗(yàn)研究姓名張琪申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別博士專(zhuān)業(yè)外科學(xué)（肝外）指導(dǎo)教師吳孟超錢(qián)其軍20040501第二軍醫(yī)大學(xué)中文摘要博士論史雙調(diào)控減毒增殖腺病毒CNHK500治療肝癌的實(shí)驗(yàn)研究【摘要】缺乏腫瘤特異性是現(xiàn)今許多腫瘤治療方案所共同面臨的一個(gè)主要問(wèn)題，因此研發(fā)出新的腫瘤靶向機(jī)制的治療方法顯得非常必要。腫瘤細(xì)胞特異性增殖病毒，又稱(chēng)溶瘤病毒，在腫瘤治療中極具前景，它具有選擇性地在腫瘤細(xì)胞中增殖、在腫瘤間自行擴(kuò)散的優(yōu)點(diǎn)，且同現(xiàn)有的治療手段無(wú)交叉耐藥作用。到目前為止，已有十余種不同類(lèi)型的選擇性增殖型病毒進(jìn)入到臨床試驗(yàn)中，其中包括選擇性增殖型腺病毒CRAD、單純皰疹病毒HSV、痘苗病毒、呼吸道腸道過(guò)濾性病毒及新城疫病毒。為達(dá)到選擇性增殖的目的，對(duì)選擇性增殖性腺病毒最常采用如下兩種分子改造策略其一選擇性缺失病毒在正常細(xì)胞復(fù)制必需而在腫瘤細(xì)胞中非必需的基因，這些基因包括腺病毒的EIA基因及E1B基因，它們可以滅活在腫瘤細(xì)胞內(nèi)常突變的抑癌基因RB或P53。這種改造后的增殖病毒在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中療效顯著，并已進(jìn)入臨床試驗(yàn)，經(jīng)典的如美國(guó)ONYX藥物公司研制的E1B一55KD缺失的ONYX一015，其聯(lián)合常規(guī)化療5FU、順鉑治療30例復(fù)發(fā)的頭頸部腫瘤患者，臨床有效率可達(dá)63％，但作為單劑治療療效僅在20％左右，可能同E1B基因同時(shí)也參與晚期MRNA轉(zhuǎn)運(yùn)出核的過(guò)程這一特性有關(guān)。另一改造策略是利用組織或腫瘤特異性啟動(dòng)子，如AFP、MUCL，PSA及PS2等，來(lái)調(diào)控腺病毒增殖的必需基因，這種改造后的病毒在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中非常成功，前列腺腫瘤特異性增殖型腺病毒CN一706及CV一787已進(jìn)入臨床試驗(yàn)，然而經(jīng)此途徑改造的病毒其增殖被局限于僅能表達(dá)相應(yīng)腫瘤特異性抗原的腫瘤類(lèi)型。腫瘤細(xì)胞的無(wú)限增殖和瘤內(nèi)缺氧微環(huán)境的存在是惡性實(shí)體瘤的主要特性。腫瘤的無(wú)限增殖能力主要靠端粒酶的激活來(lái)不斷地維持端粒的長(zhǎng)度而達(dá)到的。端粒酶在大多惡性腫瘤細(xì)胞中處于激活狀態(tài)而在正常細(xì)胞中卻沒(méi)有活性或者活性很低，是目前所報(bào)道最為廣譜的腫瘤生物分子標(biāo)記。人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶HTERT是維持端粒酶活性所必需的催化亞單位，它的表達(dá)調(diào)控在轉(zhuǎn)錄水平上。利用端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子HTERT來(lái)調(diào)控病毒復(fù)制增殖所必需的基因，理論上可使病毒選擇性在端粒酶陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞中增殖。同時(shí)在腫瘤細(xì)胞的惡性增殖過(guò)程中，不斷增多的腫瘤細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞耗氧量的劇增，容易造成腫瘤內(nèi)缺氧微環(huán)境的形成，這在人實(shí)體瘤顯得尤為明顯。缺氧進(jìn)而可誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子一1HIF，1的形成，

簡(jiǎn)介：目的該課題通過(guò)對(duì)慢性乙肝病毒攜帶者血漿皮質(zhì)醇水平及細(xì)胞免疫狀態(tài)的變化研究，從機(jī)體內(nèi)分泌系統(tǒng)對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)控方面進(jìn)一步探討HBV感染的慢性化的機(jī)制。方法慢性乙肝病毒攜帶者60例，其中HBEAG陽(yáng)性者36例，HBEAG陰性者24例。正常對(duì)照10例。用放射免疫法測(cè)定血漿皮質(zhì)醇，用流式細(xì)胞法檢測(cè)外周血T細(xì)胞亞群，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果與正常對(duì)照比較，慢性乙肝病毒攜帶者血漿皮質(zhì)醇明顯升高。T淋巴細(xì)胞亞群中CD4細(xì)胞數(shù)比例有所下降但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義、CD4CD8比值明顯下降，CD8細(xì)胞數(shù)增多P＜001。HBEAG陽(yáng)性組與HBEAG陰性組比較，HBEAG陽(yáng)性組血漿皮質(zhì)醇升高P＜005，CD8細(xì)胞數(shù)比例增多，CD4CD8比值升高P＜005，二者在CD4細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著差異P＞005。結(jié)論由以上結(jié)果，提示慢性乙肝病毒攜帶者存在著血漿皮質(zhì)醇水平的增高及細(xì)胞免疫功能的失衡，兩者之間可能存在著直接或間接的因果關(guān)系，對(duì)于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)乙肝免疫耐受的機(jī)制及其如何打破這種免疫無(wú)應(yīng)答狀態(tài)指導(dǎo)臨床治療可能具有重要意義。

簡(jiǎn)介：目的探討山東地區(qū)慢性乙型肝炎、乙肝病毒攜帶者、乙肝病毒感染后自然恢復(fù)者與HLADRB1等位基因之間的相關(guān)性了解HBV感染后各種預(yù)后的遺傳背景。方法乙肝病毒相關(guān)抗原抗體系統(tǒng)采用酶聯(lián)免疫法進(jìn)行檢測(cè)HBVDNA定量用ROCHELIGHTCYCLER熒光PCR檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)肝功能包括轉(zhuǎn)氨酶、血漿白蛋白、球蛋白等使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)HLADRB1等位基因采用聚合酶鏈反應(yīng)序列特異性引物PCRSSP技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果①、依據(jù)乙肝病毒相關(guān)抗原抗體指標(biāo)和HBVDNA定量結(jié)果分為HBV高復(fù)制狀態(tài)和HBV低復(fù)制狀態(tài)進(jìn)行二者之間的HLADRB1等位基因頻率的比較發(fā)現(xiàn)等位基因HLADRB10701在HBV高復(fù)制狀態(tài)組中出現(xiàn)頻率比低復(fù)制狀態(tài)組明顯升高45％VS125％P005。

簡(jiǎn)介：第一部分SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)、CVB3感染心肌細(xì)胞模型的建立目的成功建立病毒性心肌炎病毒直接感染心肌細(xì)胞的體外模型，為進(jìn)一步從心肌細(xì)胞分子生物學(xué)和病理學(xué)的角度，探討病毒性心肌炎病毒損傷階段的發(fā)病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。方法以柯薩奇B3M病毒感染新生SD大鼠的培養(yǎng)心肌細(xì)胞，觀察感染后細(xì)胞病變、搏動(dòng)情況、并用免疫組化法來(lái)確定心肌細(xì)胞的純度，采用RTPCR方法擴(kuò)增出CVB3的特異性條帶。結(jié)果培養(yǎng)的SD大鼠搏動(dòng)心肌細(xì)胞經(jīng)ΑACTIN免疫組化染色后確定其純度達(dá)到95％以上，感染柯薩奇B3病毒后，逐步出現(xiàn)了細(xì)胞病變，細(xì)胞停止搏動(dòng)，心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中肌酸激酶CKMB的含量明顯增高，RTPCR并可以擴(kuò)增出CVB3特異性條帶。結(jié)論柯薩奇病毒感染心肌細(xì)胞的體外模型可以作為體外研究病毒性心肌炎的基礎(chǔ)。第二部分SOCS1基因和顯性突變體SOCS1基因綠色熒光表達(dá)載體的構(gòu)建及其在心肌細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)目的構(gòu)建SOCS1基因和顯性失活突變體SOCS1DNSOCS1基因的綠色熒光表達(dá)載體，并在心肌細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)方法現(xiàn)將PCDNA30SOCS1和PCDNA30DNSOCS1兩個(gè)基因分別用ECI和XHOI進(jìn)行限制性雙酶切得到SOCS1和DNSOCS1兩目的基因；然后將PEGFPC1用ECI和SALI進(jìn)行雙酶切，得到載體片段，把兩個(gè)目的基因定向克隆到綠色熒光載體PEGFPC1中，即構(gòu)建了SOCS1和DNSOCS1兩基因的綠色熒光表達(dá)載體PEGFPC1SOCS1和PEGFPC1DNSOCS1。然后利用LIPOFECTAMINE2000轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)將兩基因分別轉(zhuǎn)染到原代心肌細(xì)胞。結(jié)果在原代心肌細(xì)胞中成功表達(dá)了綠色熒光真核表達(dá)載體PEGFPC1SOCS1和PEGFPC1DNSOCS1，48小時(shí)表達(dá)效率達(dá)2520±625％。結(jié)論我們首先構(gòu)建了SOCS1和顯性失活突變SOCS1基因的綠色熒光表達(dá)載體PEGFPC1SOCS1和PEGFPC1DNSOCS1，利用脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞中并成功的進(jìn)行了表達(dá)，為下一步的研究奠定基礎(chǔ)。第三部分受病毒感染的心肌細(xì)胞中SOCS1降低IFNΓ誘導(dǎo)的JAKSTAT信號(hào)通路敏感性及機(jī)制的初步研究目的在病毒性心肌炎細(xì)胞模型中，觀察JAKSTAT信號(hào)通路的特異性?xún)?nèi)源抑制物SOCS1及其顯性失活突變體SOCS1DNSOCS1對(duì)IFN?？笴VB3活性的影響。本研究將探索在病毒性心肌炎中SOCS1對(duì)IFNΓ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用，并從IFNΓ受體和干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)物合成的水平研究其效應(yīng)改變的機(jī)制。方法構(gòu)建PEGFPC1SOCS1及PEGFPC1DNSOCS1的真核表達(dá)載體，以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞后，加用干擾素Γ刺激細(xì)胞并感染病毒，采用熒光顯微鏡檢測(cè)心肌細(xì)胞中SOCS1和DNSOC1的表達(dá)，同時(shí)利用WESTERNBLOT法測(cè)定不同條件下STAT1STAT3JAK1的表達(dá)水平并測(cè)定病毒滴度，采用RTPCR方法測(cè)定干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)物2’，5’寡腺苷酸合成酶25OAS和干擾素Γ受體IFNGR1MRNA水平。結(jié)果與轉(zhuǎn)染DNSOCS1組相比，在轉(zhuǎn)染SOCS1組病毒滴度高，而心肌細(xì)胞存活率低，心肌細(xì)胞搏動(dòng)時(shí)間短，磷酸化STAT1，JAK1的表達(dá)很少。而在DNSOCS1組，磷酸化STAT1，JAK1的表達(dá)更明顯，心肌細(xì)胞存活率高，細(xì)胞病變少見(jiàn)，干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)物25OAS的MRNA表達(dá)較高。在轉(zhuǎn)染SOCS1和DNSOCS1組均無(wú)STAT3的磷酸化表達(dá)，另外，干擾素Γ受體和STAT3的水平不變。結(jié)論在病毒性心肌炎中，干擾素Γ激活了JAK1STAT1通路，同時(shí)SOCS1可以抑制干擾素誘導(dǎo)的抗病毒蛋白產(chǎn)物的表達(dá)，SOCS1參與了病毒性心肌炎的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，可以為我們?cè)谥委煵《拘孕募⊙字刑峁┮粋€(gè)新的治療靶點(diǎn)。

簡(jiǎn)介：HPV感染是常見(jiàn)的性傳播疾病，與宮頸癌及泌尿生殖道相關(guān)癌癥的發(fā)生關(guān)系密切，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康。開(kāi)發(fā)安全有效的HPV預(yù)防疫苗有望消滅或顯著降低。HPV感染造成的危害，具有十分重大的社會(huì)意義。我實(shí)驗(yàn)室正在研究開(kāi)發(fā)HPV基因工程疫苗，迫切需要可簡(jiǎn)便有效對(duì)候選疫苗的保護(hù)性進(jìn)行評(píng)估的方法。目前的HPV體外感染模型在實(shí)驗(yàn)周期、穩(wěn)定性、滴度等方面存在各自的缺點(diǎn)，而新型實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)的發(fā)展為構(gòu)建更有效的感染模型提供了有利條件。桿狀病毒近幾年來(lái)被發(fā)現(xiàn)可作為一種對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的新型基因轉(zhuǎn)移載體，相比其它基因轉(zhuǎn)移方法具有許多獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。本論文即探討了應(yīng)用重組桿狀病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中構(gòu)建HPV假病毒的可行性。為了更有效的獲得HPV假病毒本論文對(duì)重組桿狀病毒對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移方法進(jìn)行了研究，建立了更為簡(jiǎn)便、快捷且高效的基因轉(zhuǎn)移方法。該方法被成功用于建立了有效的HPV16假病毒體外感染模型，以及鑒定桿狀病毒滴度的新方法。本研究利用BACTOBAC系統(tǒng)、增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP和CMVT7聯(lián)合啟動(dòng)子構(gòu)建對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的桿狀病毒基因轉(zhuǎn)移載體，首先探討了直接使用重組桿狀病毒感染后的昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移的可行性。將重組桿狀病毒感染4D后的SF9細(xì)胞培養(yǎng)上清≥10107PFUML直接與HEPG2細(xì)胞37℃作用12H，可獲得高于95％的基因轉(zhuǎn)移效率，證明了重組桿狀病毒感染后的昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)上清可直接用于高效轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)間和稀釋比例的優(yōu)化，顯示用哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基等體積稀釋后的帶毒上清可兼具高效和低損傷的特點(diǎn)。應(yīng)用上述結(jié)果本研究首次提出并初步建立了重組桿狀病毒上清轉(zhuǎn)導(dǎo)法。該方法與脂質(zhì)體、重組逆轉(zhuǎn)錄病毒、重組痘苗病毒進(jìn)行的對(duì)比顯示其具有高效、低毒的優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用該方法對(duì)27種不同類(lèi)型及組織來(lái)源的哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，包括16種人類(lèi)組織細(xì)胞、9種嚙齒類(lèi)組織細(xì)胞和2種猴組織細(xì)胞，結(jié)果顯示該方法具有較好的適用性，可有效轉(zhuǎn)導(dǎo)大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞。并發(fā)現(xiàn)重組桿狀病毒對(duì)靈長(zhǎng)類(lèi)來(lái)源細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移效率顯著高于對(duì)嚙齒類(lèi)來(lái)源細(xì)胞，對(duì)貼壁細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移效率顯著高于對(duì)懸浮細(xì)胞。結(jié)合最新的研究進(jìn)展，本研究進(jìn)一步對(duì)病毒上清轉(zhuǎn)導(dǎo)法的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行摸索優(yōu)化，并嘗試采用新方法提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。對(duì)使用不同的稀釋緩沖液和轉(zhuǎn)導(dǎo)溫度的研究結(jié)果顯示，以PBS作為稀釋緩沖液在27℃下進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)可顯著提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。在PBS環(huán)境中對(duì)比不同轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)間和稀釋比例以及不同血清含量對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)效果的影響結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率與轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)間和病毒用量均呈正相關(guān)，并首次發(fā)現(xiàn)PBS中存在血清成分不利于提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。應(yīng)用不同濃度丁酸鈉增強(qiáng)表達(dá)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，05～1MM的丁酸鈉較為合適于在CV1細(xì)胞中提高桿狀病毒載體的表達(dá)效率，更高濃度的丁酸鈉對(duì)細(xì)胞有明顯毒性。本研究首次在桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中使用離心方法，結(jié)果顯示通過(guò)600G水平離心1H即可獲得高水平的轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)效率，優(yōu)于在PBS環(huán)境中27℃孵育8H的效果，并進(jìn)一步對(duì)離心時(shí)間、離心后孵育時(shí)間、緩沖液進(jìn)行了摸索優(yōu)化。應(yīng)用上述結(jié)果本研究首次提出并建立了重組桿狀病毒上清離心轉(zhuǎn)導(dǎo)法。病毒上清以PBS為緩沖環(huán)境600G水平離心1H進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法可在獲得高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的同時(shí)顯著縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高了實(shí)驗(yàn)效率。該方法具有簡(jiǎn)便、快捷和高效的特點(diǎn)，并可作為一種常規(guī)操作方法用于日常實(shí)驗(yàn)。本研究同時(shí)探討了輔助感染可表達(dá)T7RNA聚合酶的重組痘苗病毒VVT7RP對(duì)表達(dá)的影響，顯示輔助感染VVT7RP可顯著增強(qiáng)帶有CMVT7聯(lián)合啟動(dòng)子的重組桿狀病毒的表達(dá)效果，表明將重組痘苗病毒VVT7RP與重組桿狀病毒結(jié)合可建立一種高效瞬時(shí)表達(dá)方法。本研究首次設(shè)計(jì)構(gòu)建了可同時(shí)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)HPV16L1和L2蛋白的重組桿狀病毒，并采用本研究建立的重組桿狀病毒上清離心轉(zhuǎn)導(dǎo)法，探討了通過(guò)重組桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)方法在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)組裝HPV16假病毒的可行性。細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)和透射電鏡觀察結(jié)果證實(shí)，通過(guò)該方法成功獲得了具有感染能力的HPV16假病毒。應(yīng)用已被證實(shí)的4株HPV16單抗，證明該假病毒感染模型可應(yīng)用于進(jìn)行中和實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用該模型，從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的18株HPV16單抗中篩選獲得2株中和單抗3D10和PD1，同時(shí)證明本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的候選基因工程疫苗HPV16VLP可激發(fā)BALBC小鼠產(chǎn)生具有中和能力的保護(hù)性體液免疫。該模型的成功建立為HPVL6中和抗體的篩選和HPV16預(yù)防疫苗的研究提供了必要的條件和有力的支持，也為進(jìn)一步構(gòu)建其它型別的HPV假病毒體外感染模型提供了基礎(chǔ)。本研究還首次嘗試了使用HPV16假病毒對(duì)昆蟲(chóng)細(xì)胞的感染實(shí)驗(yàn)，顯示HPV16假病毒可能具有將核酸導(dǎo)入昆蟲(chóng)細(xì)胞的能力。大量的關(guān)于重組桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用研究實(shí)踐顯示，準(zhǔn)確測(cè)定病毒滴度對(duì)于保持蛋白生產(chǎn)和研究實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性是十分重要的。本研究綜合了應(yīng)用重組桿狀病毒上清離心轉(zhuǎn)導(dǎo)法可高效轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的特點(diǎn)以及輔助感染VVT7RP可顯著增強(qiáng)CMVT7聯(lián)合啟動(dòng)子表達(dá)水平的特點(diǎn)，提出了新型的可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中測(cè)定重組桿狀病毒滴度的方法。本研究設(shè)計(jì)構(gòu)建了同時(shí)具有在昆蟲(chóng)細(xì)胞中和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高效表達(dá)報(bào)告基因的重組桿狀病毒。應(yīng)用該病毒首先在昆蟲(chóng)細(xì)胞中準(zhǔn)確測(cè)定滴度，再通過(guò)梯度稀釋后離心轉(zhuǎn)導(dǎo)CV1細(xì)胞并輔助感染VVT7RP，在12～24H后直接觀察細(xì)胞發(fā)光情況，以TCID50方法計(jì)算病毒滴度。結(jié)果顯示，以CMVT7聯(lián)合啟動(dòng)子引導(dǎo)的EGFP報(bào)告基因表達(dá)元件在VVT7RP輔助下具有最高的檢測(cè)靈敏度，其測(cè)得的滴度與昆蟲(chóng)細(xì)胞中測(cè)得的滴度相當(dāng)，優(yōu)于單獨(dú)使用CMV啟動(dòng)子或T7啟動(dòng)子。本研究首次提出了可將CMVT7EGFP表達(dá)元件作為一種優(yōu)良的病毒滴度鑒定元件克隆于桿狀病毒載體上，其在昆蟲(chóng)細(xì)胞中不會(huì)進(jìn)行有效表達(dá)和干擾重組蛋白和病毒的生產(chǎn)，同時(shí)又可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行高靈敏度和快速、直觀的檢測(cè)，不需要使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。該方法為重組桿狀病毒滴度的測(cè)定提供了一種選擇。

簡(jiǎn)介：本文為了更準(zhǔn)確、更方便的尋找低毒高效的抗HBV藥物，建立了體外、體內(nèi)抗HBV藥物篩選體系，并進(jìn)行中草藥抗HBV的研究，研究?jī)?nèi)容如下1對(duì)荔枝核、紫玉盤(pán)、蠶蛾、田基黃、葉下珠、大黃等藥物進(jìn)行提取，并運(yùn)用HEPG2215細(xì)胞株進(jìn)行抗乙肝病毒的體外研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明廣西產(chǎn)的荔枝核對(duì)乙肝病毒有較好的抑制作用。2建立HEPG2215細(xì)胞株培養(yǎng)體系，同時(shí)使用SRBSUFHODAMINEB磺基羅丹明B細(xì)胞染色技術(shù)測(cè)定藥物對(duì)細(xì)胞的毒性、并采用PCR方法聚合酶鏈反應(yīng)法結(jié)合熒光探針的體外擴(kuò)增和檢測(cè)技術(shù)測(cè)定HBVDNA的含量。3采用光密度測(cè)定法和和定量PCR技術(shù)研究荔枝核提取物對(duì)HEPG2215細(xì)胞株HBSAG與HBEAG表達(dá)的抑制作用與HBVDNA含量的影響。96孔板試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)第3、6天，荔枝核提取物800，400，200，100ΜGML對(duì)HEPG2215細(xì)胞HBSAG與HBEAG的表達(dá)有明顯的抑制作用與對(duì)照組比較P＜001。24孔板試驗(yàn)。4體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用桂林麻鴨先天感染DHBV的雛鴨作為動(dòng)物模型，對(duì)荔枝核工業(yè)提取物進(jìn)行抗乙肝病毒實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明荔枝核工業(yè)提取物中劑量組2GKGD在用藥期間有抑制DHBVDNA的作用，與同組給藥前比較，T5時(shí)，P＜001；T10時(shí)，P＜001；與生理鹽水對(duì)照組比較，T15時(shí)，P＜005，鴨血清DHBVDNA均與給藥前T0比較明顯下降，抑制效果在第15天最好，結(jié)果表明荔枝核提取物在用藥期間具有一定的抑制乙肝病毒的作用。

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簡(jiǎn)介：重慶醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文重組腺病毒HIF1Α基因治療腦缺血的實(shí)驗(yàn)研究姓名陶陶申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別博士專(zhuān)業(yè)神經(jīng)病學(xué)指導(dǎo)教師胡長(zhǎng)林20050428重慶醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文英文縮寫(xiě)ADADHIF．1QAⅣFPBPBWCB．MECDNACSCLCIRDEPCDNADNTPDABDMSODTTDDWEDL’AEPEPOFCSGFPHEHIF1HIF．1DHRP】HC符號(hào)說(shuō)明英文全稱(chēng)ADENOVIRUSRECOMBINANTADENOVINLSCONTAININGHIF一1OGENEAMPIEILLINBASEPAIRBRAINWATERCONTENTBMEREAPTOETTHANOLCOMPLEMENTARYDEOXYNUCLEICACIDCHLORIDECESIUMCEREBRALISCHEMICREPERFUSIONDIETHYLPYROCARBONATEDEOXYNUCTEICACID。DEOXYNUCLEOSINETNPHOSPHATEDIAMINOBENZIDINEDIMETHYLSULFOXIDEDITHIOTHREITOLDOUBLEDILUTEDWATERETHYLENEDAMINETETRAACETICACIDEPPENDORFERYTHROPOIETINFETALCALFSELALMGREENFLUORESCENCEPROTEINHEMATOXYLINANDEOSINHYPOXIAINDUCIBLEFACTORIHYPOXIAINDUCIBLEFACTOR1ALPHAHORSERADISHPEROXIDASELMMUNOHISTOCHEMISTRY中文全稱(chēng)腺病毒HIF．1O重組腺病毒氨芐青霉素堿基對(duì)腦水含量B．巰基乙醇互補(bǔ)脫氧核糖核酸氯化銫腦缺血再灌注焦碳酸二乙脂脫氧核糖核酸脫氧核苷三磷酸二氨基聯(lián)苯胺二甲基亞砜二硫蘇糖醇雙蒸水乙二胺四乙酸二鈉微量離心管紅細(xì)胞生成素胎牛血清綠色熒光蛋白蘇木精、伊紅缺氧誘導(dǎo)因子一1缺氧誘導(dǎo)因子1D辣根過(guò)氧化物酶免疫組化1

簡(jiǎn)介：點(diǎn)擊查看更多SARS病毒膜融合抑制劑鑒定、S2結(jié)構(gòu)域原核表達(dá)及多克隆抗體的制備.pdf精彩內(nèi)容。

簡(jiǎn)介：本文共包括兩部分第一部分中，共合成化合物13個(gè)，其中格爾德霉素衍生物7個(gè)I～Ⅴ，Ⅸ，ⅩⅢ，末見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道的化合物10個(gè)ⅣⅩⅢ?？笻SVⅠ活性測(cè)定中顯示出抑制HSVⅠ活性的化合物7個(gè)Ⅰ～Ⅴ，Ⅶ，Ⅷ。所得化合物結(jié)構(gòu)均經(jīng)過(guò)核磁1HNMR、質(zhì)譜確證?？笻SVⅠ活性結(jié)果顯示，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的抗HSVⅠ活性雖較格爾德霉素有所降低，但細(xì)胞毒性降低更為明顯。阿昔洛韋衍生物Ⅶ和Ⅷ均有較好的抑制HSVⅠ活性。在第二部分，建立了富馬酸替諾福韋酯光學(xué)異構(gòu)體含量以及富馬酸替諾福韋酯含量及有關(guān)物質(zhì)的HPLC檢測(cè)方法。富馬酸替諾福韋酯光學(xué)異構(gòu)體含量測(cè)定采用DAICELCHIRALCELODH5ΜM46250MM色譜柱，以正己烷異丙醇二乙胺851502％為流動(dòng)相，流速為05MLMIN，柱溫為室溫，檢測(cè)波長(zhǎng)為260NM。富馬酸替諾福韋酯含量及有關(guān)物質(zhì)的HPLC檢測(cè)采用ALLTECHMIXEDMODEC8ANION100A7ΜM25046MM色譜柱，乙腈磷酸鉀鹽緩沖液002MOLL，KOH調(diào)節(jié)PH至606535為流動(dòng)相，10MLMIN流速，柱溫為室溫，檢測(cè)波長(zhǎng)為260NM。

簡(jiǎn)介：點(diǎn)擊查看更多綠色熒光蛋白表達(dá)的重組巨細(xì)胞病毒的構(gòu)建及抗巨細(xì)胞病毒藥物篩選.pdf精彩內(nèi)容。

簡(jiǎn)介：四川大學(xué)博士學(xué)位論文重組腺病毒載體介導(dǎo)的反義基質(zhì)金屬蛋白酶2基因治療增殖期血管瘤的實(shí)驗(yàn)研究姓名曾凡偉申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別博士專(zhuān)業(yè)外科學(xué)指導(dǎo)教師岑瑛20050418四川走學(xué)博士學(xué)位論文英文縮寫(xiě)英文縮寫(xiě)中文全名VECVASCULARENDOTHELIALCELL血管內(nèi)皮細(xì)胞ADADENOVIRUS腺病毒ADVADENOVIRSVECTOR腺病毒載體DMEMDUIBECCO’SMODIFIEDEAGLEMEDIUM極限必需培養(yǎng)基PCRPOLYMERASECHAIL3REACTION多聚合酶鏈反應(yīng)ADAMMP一2腺病毒介導(dǎo)的反義基質(zhì)金屬蛋白酶一2ADGFP腺病毒介導(dǎo)的綠色熒光蛋白AMLP2AVERSEMMP一2反義基質(zhì)舍屬蛋白酶一2BDBASEPALR堿基對(duì)BSABOVINESERUMALBUMN小牛血清CDNACOAOIEMENTARYDNA互補(bǔ)脫氧核糖核酸CD，HUMANHEIITLOPOIELICPROGENITORANTIGEN人原始造血細(xì)胞抗原CPECYTOPATHETICEFFECT細(xì)胞病態(tài)效應(yīng)DDAY天DABDIAMINOBENZIDIBE二氨基聯(lián)苯胺DMSODJMETHYLSULFOXIDE二亞基亞砜FCMFLOWCYTOMETRY流式細(xì)胞術(shù)；FPGREENFLUORESCENTPROTEIN綠色熒光蛋白HOUR小時(shí)