簡介：目的檢測急性病毒性心肌炎患兒外周血中白介素6IL6、血管細胞粘附分子1VCAM1的濃度并分析其相關(guān)性，探討其在急性病毒性心肌炎發(fā)病機制中的部分作用。方法選擇臨床診斷急性病毒性心肌炎患兒30例，為實驗組，健康兒童30名，為對照組。采用實驗研究策略，引入雙抗體夾心ELISA法，檢測兩組外周血中的IL6、VCAM1的濃度，并進行分析比較。結(jié)果實驗組IL6血清含量為10726±1142NGL，比對照組的5749±945NGL明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義T18389，P0000結(jié)論急性病毒性心肌炎的發(fā)病機制中有IL6、VCAM1的參與，提示細胞因子及免疫應答在其的發(fā)生發(fā)展中有重要作用。

簡介：目的研究呼和浩特地區(qū)2008年6月～2009年5月嬰幼兒輪狀病毒性腹瀉的流行特征及輪狀病毒基因型。方法采集內(nèi)蒙古婦幼保健醫(yī)院2008年6月～2009年5月所有≤59月齡的住院腹瀉患兒糞便標本313份。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗ELISA方法篩查輪狀病毒；對檢測出輪狀病毒抗原陽性的標本進一步用巢式逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應NESTEDRTPCR對六種流行的VP7基因型G1、G2、G3、G4、G8、G9和五種流行的VP4基因型P8、P4、P6、P9、P10進行分型；對未分出P型的樣本核酸通過RTPCR擴增VP4基因并進行基因測序測序結(jié)果用DNASTAR軟件包分析；最后整理數(shù)據(jù)應用SPSS130統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析。結(jié)果1313份糞便標本中125份RV抗原陽性陽性率為3994％。RV高發(fā)月份為11～1月高發(fā)月齡為12～23月齡組。2RV腹瀉入院前平均每日腹瀉次數(shù)多于非RV腹瀉RV腹瀉比非RV腹瀉更易引起嘔吐。3125份陽性標本進行VP7基因分型結(jié)果為G1型648％81125、G2型24％3125、G3型144％18125、G9型08％1125、G1G3混合型168％21125、G2G3混合型08％1125未發(fā)現(xiàn)G4、G8型。4125份陽性標本進行VP4基因分型結(jié)果為P8型84％105125、P4型4％6125、P8P4型16％212513份未分出型別未發(fā)現(xiàn)P6、P9、P10型。513份未分出具體型別的樣本核酸有5份擴增出VP4基因片段測序結(jié)果顯示這五份樣本全部為P8型它們彼此同源性在916％～979％之間與GENEBANK中韓國株KMR061和CAU219、俄羅斯株NOV09D182、泰國株CMH04405、中國武漢株WH1194、馬拉維株OP351都有很高的同源性。結(jié)論RV是引起呼和浩特地區(qū)嬰幼兒腹瀉的主要病原之一其高發(fā)月份為11～1月高發(fā)月齡為12～23月齡組。RV在呼和浩特地區(qū)的流行呈現(xiàn)多樣性但主要的GP流行株在20086～20095期間為G1P8。首次在內(nèi)蒙地區(qū)檢出G9型RV感染。測序的RVVP4基因片段相對保守變異不大。

簡介：研究目的1估計云南省個舊市暗娼及礦工的HIVSTIS感染率；2分析該地暗娼及礦工HIVSTIS的可能危險因素；3評價該地暗娼及礦工HIV相關(guān)知識、態(tài)度和行為；4描述該地暗娼及礦工的流動情況。研究方法2005年12月～2006年1月，在云南省個舊市，分別以普查方式和方便抽樣的方法，招募并調(diào)查了暗娼239人、礦工526人。對所有研究對象進行一對一面對面訪談方式進行匿名問卷調(diào)查，同時采集血標本檢測HLVELISA法初篩，蛋白印跡法確認、梅毒螺旋體RPR法初篩、TPPA法確認、HSV2ELESA法，采集女性宮頸分泌物標本和男性尿標本檢測淋病奈瑟菌和衣原體復合PCR法、采集女性陰道分泌物標本檢測滴蟲濕片法鏡檢，對所有研究對象的尿液標本進行嗎啡檢測ACONMOP試紙法。研究結(jié)果1、暗娼人群1暗娼HIV感染率為186﹪，其中，吸毒暗娼感染率554﹪，非吸毒暗娼感染率為18﹪。多因素LOGISTIC回歸分析發(fā)現(xiàn)，吸毒3994、經(jīng)常變換工作場所619是當?shù)匕垫礁腥綡IV的主要的危險因素；隨著當?shù)匕垫侥挲g的增加，HIV感染人數(shù)呈上升趨勢117。25種SFIS的總感染率為749﹪。其中梅毒、單純皰疹病毒2型HSV2、淋病奈瑟菌、沙眼衣原體、滴蟲感染率分別為38﹪，646﹪，44﹪，153﹪，48﹪。HIV473感染和安全套使用046是影響STIS的因素。3294﹪感染2種或2種以上病原體。4272﹪的暗娼自我報告使用過毒品，其中908﹪注射過毒品。暗娼與非付費性伴和付費性伴不持續(xù)使用安全套的比例分別為7616﹪和3277﹪X1363955，DF4，P289275，DF3，P00001。6通過暗娼收集到114﹪的付費性伴是礦工。2、礦工人群1礦工HIV感染率為06﹪。4種STIS的總感染率為183﹪，其中，HSV2、梅毒、淋病奈瑟菌、沙眼衣原體的感染率分別為1329﹪、14﹪、02﹪和516﹪。198﹪的礦工合并感染2種或2種以上HIVSTIS。多因素分析發(fā)現(xiàn)多性伴196和吸毒378是HIVSTIIS感染的危險因素。2有過性行為的對象中，586﹪與2個及2個以上的人發(fā)生過性關(guān)系，161﹪有過商業(yè)性行為，849﹪最近1年從不使用安全套。在商業(yè)性行為中，643﹪在嫖娼時從不使用安全套。527﹪在個舊市區(qū)找暗娼。295﹪的礦工與他人共用過剃須刀。HIV三種傳播途徑的正確回答率為6005﹪，所有艾滋病相關(guān)問題正確回答率為335﹪。39734﹪的礦工是離家外出打工者，其中4238﹪換過工作城市。結(jié)論目前云南省個舊市暗娼人群中HIVSTIS流行形勢嚴重，合并感染率高，給當?shù)豀IVSTIS的控制帶來嚴峻挑戰(zhàn)。本研究發(fā)現(xiàn)該地暗娼HIV感染的主要因素是吸毒和場所之間流動。無保護性行為和流動是HLVSTIS向其性伴傳播的因素，尤其是同定性伴。急需對暗娼人群進行合理的教育和干預，防止HIVSTIS繼續(xù)傳播蔓延。HIV在當?shù)氐V工中總體上呈低流行，但引起礦工HLV感染的因素廣泛存在。本研究發(fā)現(xiàn)多性伴和吸毒是該地礦工HIVSTIS感染的主要影響因素，少數(shù)民族礦工HIVSFIS感染率高于漢族礦工。因此，對礦工人群有針對性的宣傳教育和行為干預迫在眉睫。通過暗娼了解其付費性伴，可以發(fā)現(xiàn)艾滋病控制的重點人群。

簡介：腎綜合征出血熱（HEMRHAGICFEVERWITHRENALSYNDROME，HFRS）是由漢坦病毒（HANTANVIRUS，HV）引起的一種急性病毒性傳染病，臨床上以發(fā)熱、出血、腎功能損害和免疫功能紊亂為突出表現(xiàn)。我國是世界上HFRS疫情最嚴重的國家，流行地區(qū)廣、發(fā)病人數(shù)多、病死率較高，防治任務十分艱巨。HV屬于布尼亞病毒科（BUNYAVIRIDAE）漢坦病毒屬。目前可將HV分為十種血清型或二十幾種基因型，其中常見的對人類造成危害比較嚴重的型別有漢灘病毒（HTNV）、漢城病毒（SEOV）、普馬拉病毒（PUUV）、辛若柏病毒（SNV）等。以往國內(nèi)外的大量研究工作表明，HV的M基因編碼的囊膜糖蛋白（GLYCOPROTEIN，GP）是重要的結(jié)構(gòu)蛋白，HV的中和抗原表位主要分布在GP上，特別是G2上。GP可刺激機體產(chǎn)生中和抗體，對感染動物和人體均具有保護作用。此外，GP還具有血凝活性、細胞融合活性及受體結(jié)合活性，因此GP被認為是一種重要的保護性抗原，是漢坦病毒基因工程疫苗的主要候選成份。但是，該蛋白免疫原性較弱，已有的抗GP的抗體親和（結(jié)合）活性均不高，并且在目前應用比較廣泛的幾種表達系統(tǒng)中，GP表達水平亦不理想。因此也尚未建立針對GP的有效的檢測方法，這些都使得對GP的研究受到了很大的限制。本研究根據(jù)GP上既有中和活性位點又有血凝活性位點的特點，利用HTNV76118株血凝素免疫小鼠制備單克隆抗體（MAB），并以含有G1、G2編碼基因的真核載體G1PDISPLAY、G2PDISPLAY轉(zhuǎn)染的CHO細胞篩選抗G1和G2的特異性MAB，對這些MAB的免疫學特性進行了初步鑒定；同時將編碼HTNV76118株G2的基因片段分別克隆入畢赤酵母胞內(nèi)型表達載體PPIC35K和分泌型表達載體PPICZΑA，轉(zhuǎn)化酵母工程菌株，篩選陽性轉(zhuǎn)化子并進行了誘導表達。1抗HTNVG1、G2MAB的制備及鑒定以蔗糖丙酮法從HTNV76118株感染的乳鼠腦中提取血凝素，以此血凝素免疫BLABC小鼠，取免疫小鼠的脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP20融合，以血凝抑制試驗（HIA）進行篩選，獲得了4株能穩(wěn)定分泌抗HTNV血凝素MAB的雜交瘤細胞系，分別命名為1A6、1G12、2B2和2H5。用分別含有編碼HTNVG1和G2基因的真核表達載體G1DISPLAY、G2DISPLAY轉(zhuǎn)染CHO細胞，并用此轉(zhuǎn)染細胞檢測上述4株MAB。結(jié)果表明，MAB1G12與G1DISPLAY轉(zhuǎn)染CHO細胞呈陽性反應，提示其是G1特異性的；2B2和2H5均與G2DISPLAY轉(zhuǎn)染CHO細胞呈陽性反應，提示它們是G2特異性的；而1A6則與G1DISPLAY轉(zhuǎn)染CHO細胞和G2DISPLAY轉(zhuǎn)染CHO細胞均呈陽性反應。采用HIA檢測MAB1A6、1G12、2B2、2H5腹水的血凝抑制效價，結(jié)果分別為1∶4000、1∶16000、1∶16000和1∶8000。中和試驗的結(jié)果表明，4株MAB均有一定的中和活性，最高中和效價為1∶40。2HTNVG2蛋白在畢赤酵母中的表達與鑒定將HTNV76118株G2基因片段分別克隆入畢赤酵母胞內(nèi)型載體（PPIC35K）和分泌型載體（PPICZΑA），構(gòu)建了含有編碼HTNVG2蛋白基因的表達載體PPIC35KG2和PPICZΑAG2，分別轉(zhuǎn)化畢赤酵母工程菌后用甲醇誘導表達。用SDSPAGE和WESTERNBLOT對表達產(chǎn)物進行鑒定。結(jié)果表明，PPICZΑAG2轉(zhuǎn)化菌表達產(chǎn)物中有與預期大小相符的目的蛋白條帶，采用抗HIS的MAB及HFRS患者恢復期血清的WESTERNBLOT，證實該條帶為G2蛋白。本研究獲得的針對HTNVGP（G1、G2）的特異性MAB以及HTVNG2蛋白，為進一步建立HTNVGP的檢測方法以及HTNVGP的結(jié)構(gòu)與功能研究等提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

簡介：目的了解成都市大學生艾滋病安全性行為相關(guān)認知及態(tài)度，從社會性別視角分析男女大學生艾滋病安全性行為相關(guān)認知及態(tài)度的差異和影響因素，為更好地制訂大學生艾滋病安全性行為健康教育提供依據(jù)。方法調(diào)查定量和定性調(diào)查相結(jié)合的方法問卷調(diào)查和個案訪談。樣本隨機抽取成都市規(guī)模和影響較大的一所綜合性大學，分層整群抽取一年級至三年級在校學生共計790名男生355名，女生398名。個案訪談采用定額抽樣方法，在接受問卷調(diào)查的對象中按每年級10％的比例尋找訪談對象，最終共有60名同學接受訪談。結(jié)果本次調(diào)查發(fā)放問卷790份，回收有效問卷753份，有效率為9532％。男女生在艾滋病認識水平上差異無統(tǒng)計學意義T0410，P＞005。調(diào)查對象安全性行為知識較貧乏，完全回答正確安全套的使用知識共七題的只有57％，男生安全性行為知識水平高于女生T2016，P＜005。729％的人對婚前性行為持贊成或無所謂態(tài)度，男生對待婚前性行為的態(tài)度比女生更寬容和理解X62457，P＜O01。調(diào)查對象中有178人有過性交經(jīng)歷，其中349％的男生和136％的女生，性別間差異有統(tǒng)計學意義X47434，P＜001，男生性交發(fā)生率高于女生。非條件LOGISTIC逐步回歸結(jié)果顯示，隨著年齡的增長性交行為發(fā)生率也在增加，男生、居住在城市、家庭人口數(shù)越少、母親文化程度低、曾經(jīng)有過戀愛對象或正在談戀愛、人工流產(chǎn)的認識水平較差、發(fā)生過愛撫行為以及對婚前性行為持贊成態(tài)度的學生更容易發(fā)生性交行為。從社會性別角度分析，居住在城市、年齡越大、母親文化程度低、個人月均消費高及發(fā)生過愛撫行為的男生更容易發(fā)生性交行為，而隨著年齡的增長、月均消費較高、曾有戀愛對象或正在戀愛、對人工流產(chǎn)的認識水平較差、發(fā)生過愛撫行為、對婚前性行為持贊成態(tài)度的女生更易發(fā)生性交行為。造成性別差異的原因體現(xiàn)在生物學、社會和文化等因素上，傳統(tǒng)的社會文化觀念對女生的影響仍舊很大，社會存在男女道德雙重標準也影響著大學生對待性行為的態(tài)度。定性調(diào)查結(jié)果表明大學生對待艾滋病的態(tài)度越來越積極，對婚前性行為的認識呈多元化。在性知識獲取途徑上，受訪者以往的性知識來自于與同伴交流、書刊、網(wǎng)絡等，卻很少與父母交談性相關(guān)問題。結(jié)論大學生中加強艾滋?。踩孕袨榻】到逃侵陵P(guān)重要的，在設置教育內(nèi)容時應根據(jù)性別不同而有所側(cè)重，鼓勵和調(diào)動女生參與性健康教育的積極性。在性健康教育中強調(diào)疾病風險亦不可能顯著減少婚前性行為，性健康教育應與思想教育和素質(zhì)教育相結(jié)合。充分發(fā)揮學校教育、家庭教育及同伴教育在性健康教育中的作用，促進大學生思想道德素質(zhì)的提高。

簡介：點擊查看更多M-,2-e基因誘導的特異性抗流感病毒免疫應答及保護作用.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：南方醫(yī)科大學碩士學位論文攜帶人內(nèi)皮抑素基因腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建及相關(guān)功能的研究姓名袁璦芹申請學位級別碩士專業(yè)婦產(chǎn)科學指導教師何援利20070520中文摘要目的為深入研究內(nèi)皮抑素在子宮內(nèi)膜異位癥治療中的療效，我們擬構(gòu)建包含人內(nèi)皮抑素HENDOSTATIN基因的缺陷型腺病毒質(zhì)粒，利用相應的包裝細胞系，制備具有感染能力的腺病毒顆粒，去感染與血管生成密切相關(guān)的血管內(nèi)皮細胞，觀察對內(nèi)皮細胞的影響，驗證并探討其功能和作用機制，為進一步研究內(nèi)皮抑素在子宮內(nèi)膜異位癥動物模型上的治療作用打下基礎(chǔ)。方法與結(jié)果1用基因工程方法獲得人內(nèi)皮抑素基因，設計特定限制性酶切位點，將內(nèi)皮抑素基因插入缺陷型腺病毒載體中。構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)測序驗證，所獲得目的基因序列與已發(fā)表的人內(nèi)皮抑素基因序列相比，第471位氨基酸編碼堿基由G突變?yōu)锳，但編碼的氨基酸都是精氨酸，與GENBANK中人內(nèi)皮抑素蛋白質(zhì)序列完全一致，屬于沉默突變型，不影響后續(xù)表達。2將重組腺病毒質(zhì)粒線性化后通過LIPOFECTAMINE2000轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，得到包含人內(nèi)皮抑素基因的完整腺病毒顆粒，通過氯化銫密度梯度離心法加以純化后，用OD260法測定其病毒滴度為52X1091FU／ML。3利用構(gòu)建好的重組人內(nèi)皮抑素腺病毒ADHENDO感染ECV304臍靜脈內(nèi)皮細胞，WPSTCRNBLOT測定HENDOSTATIN蛋白的表達情況，流式細胞術(shù)檢測ADHENDO引起ECV304細胞凋亡的情況，繪制ADHENDO感染后的ECV304細胞生長曲線。與對照組相比，病毒感染48小時后檢測到明顯的HENDOSTATIN蛋白表達，流式細胞術(shù)證實ADHENDO在感染3D后出現(xiàn)ECV304細胞凋亡，細胞生長曲線監(jiān)測顯示ECV304細胞在ADHENDO感染后生長受到明顯限制。結(jié)論通過構(gòu)建包含人內(nèi)皮抑素基因HUMANENDOSTATIN的缺陷型腺病毒質(zhì)粒，利用相應的包裝細胞系，制備具有感染能力的腺病毒ADHENDO，ADHENDO感染的N

簡介：中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院中國人民解放軍總醫(yī)院碩士學位論文兒童慢性丙型肝炎病毒基因分型與臨床特征關(guān)系的初步研究姓名王麗旻申請學位級別碩士專業(yè)內(nèi)科學（傳染?。┲笇Ы處煆堷欙w朱世殊20070524軍醫(yī)進修學院碩士論文兒童慢性丙型肝炎病毒基因分型與臨床特征關(guān)系的初步研究中文摘要研究目的了解兒童慢性丙型肝炎CHC病毒基因型與臨床表現(xiàn)、血清生化改變，肝臟病理特點的關(guān)系。對象2004年1月至2006年12月解放軍302醫(yī)院感染5科收治的年齡在2～13歲的慢性丙型肝炎患兒92例；方法統(tǒng)計學用CHISS軟件及EXTOL2003版軟件進行T，X’檢驗。結(jié)果1本組患兒男性女性3181，平均年齡為1221078歲，891％的崽兒年齡大于7歲，小于3歲的惠兒占3，2I；717％的患兒為血液傳播感染丙型肝炎病毒HCV，明顯多于其他傳播途徑PO012本組患兒多起病隱匿，基因1B型部分患兒有臨床表現(xiàn)，基因2A型的惠兒均無臨床表現(xiàn)；基因1B型組中41L的惠兒A乙T大于200U／L，基因28組中未見多于200U／L的惠兒，不同基因型患兒的血清生化學檢查比較，差異無統(tǒng)計學意義；基因1B型組中613％的惠兒CD4／CD8比值異常，較基因型2A組多見，機體免疫功能紊亂可能影響基因1B型的患兒清除病毒能力及抗病毒的療效。3本組761％的患兒HCV病毒基因型是1B型。明顯較基因LA、LA／2B，未分出型多PO01。各基因型的慢性丙型肝炎患兒的性別組成，年齡，病程相似4413％_的患兒HCVRNA水平為高載量，基因1B型患兒的病毒載量平均值是402106235106COPIE婦L，基因2A型的病毒裁量為91106237106COPIES／ML，2例26％惠兒重疊乙型肝炎病毒感染。5肝臟病理提示968％的患兒炎癥分級在L級或1級以上，258，6的惠兒在2級或2級以上基因LB型的惠兒均存在肝臟損害，炎癥2級以上的為41％；基因2A型的患兒炎癥分級及纖維化分期均未見大于2級，32％的患兒為肝硬化6依據(jù)患兒的肝臟病理炎癥分級不同，其血清病毒載量及ALT水平比較無明顯差異結(jié)論1兒童慢性丙型肝炎男性多于女性，學齡期的兒童多見，血液傳播為兒童CHC獲得感染的主要途徑2大部分的患兒起病隱匿，基因1B型的患兒較，基因2A型的患兒可能有更多的臨床表現(xiàn)3基因1B型組的患兒可能存在機體免疫功能紊亂而影

簡介：目的和意義丙型肝炎病毒（HCV）是慢性肝炎和肝癌的主要病原體之一，但對于HCV的復制和致病機制目前還是不甚清楚。宿主細胞中的許多蛋白分子可以通過與HCVRNA基因組的相互作用，調(diào)節(jié)HCV的翻譯、復制和病毒的組裝?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)的HCVRNA結(jié)合蛋白，其結(jié)合區(qū)域主要位于HCVRNA的5’UTR、3’UTR和RNA的副鏈。但是與HCVCE區(qū)（核心區(qū)）RNA結(jié)合的細胞蛋白卻很少有研究報導。本研究擬采用凝膠遷移和紫外交聯(lián)的實驗方法，從人肝癌細胞系HEPG2細胞中初步篩選與HCVCE區(qū)RNA結(jié)合的細胞蛋白分子，確定其與HCVRNA結(jié)合的具體區(qū)域，并對RNA結(jié)合蛋白進行分離、鑒定。通過研究宿主細胞蛋白與HCVC區(qū)RNA的相互作用，將有助于我們對宿主和病毒相互作用的更好理解，從而在細胞蛋白質(zhì)水平對病毒RNA的翻譯、復制和病毒蛋白表達進行調(diào)控；并有利于在丙型肝炎的預防和治療方面提出針對性的措施。方法①采用RTPCR擴增HCVC區(qū)CDNA序列，并構(gòu)建重組質(zhì)粒PGEMHCV；以PGEMHCV為模板，采用體外轉(zhuǎn)錄的方法制備DIG標記和未標記的HCVCRNA分子；將DIG標記的HCVCRNA與HEPG2細胞蛋白結(jié)合，進行凝膠遷移實驗；將DIG標記的HCVCRNA與HEPG2細胞蛋白結(jié)合，進行紫外交聯(lián)篩選實驗，并采用未標記的HCVCRNA分子進行競爭性實驗；電泳后將RNA蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜，以DIG抗體檢測NC膜上的DIG信號，判斷是否有細胞蛋白與HCVCRNA結(jié)合。②采用PCR、克隆和體外轉(zhuǎn)錄的方法，制備不同長度的HCVCRNA分子；分別將不同長度的HCVCRNA分子與細胞蛋白進行結(jié)合反應和紫外交聯(lián)實驗，確定HCVCRNA與細胞蛋白的結(jié)合區(qū)域；采用抗DIG和免疫沉淀方法，從RNA和蛋白混合物中，分離與DIG標記的HCVCRNA分子結(jié)合的細胞蛋白；通過SDSPAGE和NC膜的檢測結(jié)果的比對，切取目的蛋白條帶，進行肽指紋圖譜分析鑒定。③提取HEPG2細胞總RNA，以RTPCR方法擴增PGAMB的全基因片斷，與載體PCDNA31V5HISA連接，構(gòu)建真核表達質(zhì)粒PCDNAPGAM；以PCR方法擴增PGEMHCV中HCV核心蛋白基因片斷，與載體PCDNA30連接，構(gòu)建真核表達質(zhì)粒PCDNAHCV；經(jīng)酶切和測序鑒定后，將真核表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HEPG2細胞；以免疫細胞化學的方法，在細胞爬片上分別檢測細胞中PGAMHIS蛋白和HCV核心蛋白的瞬時表達情況。結(jié)果①從1例HCV感染者血清中擴增得到的503BPHCVCDNA序列，構(gòu)建了重組質(zhì)粒PGEMHCV，并進行了PCR、酶切鑒定和測序鑒定。②所得HCVCDNA序列與已知HCV序列（AB0929621）比較，屬于HCV1型基因C區(qū)，僅有兩個核苷酸不同，NT67（23AAK→E）和NT177（沉默突變），其余序列均一致。③通過凝膠遷移實驗初步檢測到，有HEPG2細胞蛋白與HCVCRNA分子結(jié)合。④通過紫外交聯(lián)實驗檢測到，有多個HEPG2細胞蛋白與HCVCRNA分子在體外發(fā)生了結(jié)合；隨著結(jié)合反應體系中細胞蛋白濃度的增加，HCVCRNA和蛋白的結(jié)合量隨之增多；未標記HCVCRNA對DIG標記的HCVCRNA與HEPG2細胞蛋白的結(jié)合有競爭性抑制作用。⑤3個不同長度的HCVCRNA分子（198NT、306NT和503NT）都可與HEPG2細胞蛋白在體外發(fā)生結(jié)合；其中CRNA5’端的C198RNA與細胞蛋白的結(jié)合條帶，最為清晰和銳利。⑥經(jīng)免疫沉淀后的蛋白，在NC膜上可以檢測到4條明顯的蘭紫色RNA結(jié)合蛋白帶；其中以P30蛋白條帶最為清晰，蛋白量最多。⑦從SDSPAGE膠上切取了P30蛋白條帶，經(jīng)肽指紋圖譜分析鑒定，P30蛋白為磷酸甘油酸變位酶1（PGAMB）。⑧從HEPG2細胞中，擴增得到了約為760BP的PGAMB的CDNA全基因片斷；所得PGAMB基因序列與已知PGAMB基因序列（J04173）進行比較，完全一致。⑨基因序列和蛋白讀碼框均正確的真核表達質(zhì)粒PCDNAPGAM和PCDNAHCV，分別轉(zhuǎn)染HEPG2細胞后，可在細胞爬片上檢測到PGAMHIS和HCV核心蛋白的瞬時表達。結(jié)論①在HEPG2細胞中，有多個細胞蛋白分子可以與HCV核心區(qū)RNA在體外發(fā)生特異性的結(jié)合。②HCVCRNA與HEPG2細胞蛋白的結(jié)合區(qū)域可能位于HCVC區(qū)RNA的5’端。③PGAMB可以與HCVCRNA在體外發(fā)生特異結(jié)合，提示PGAMB可能通過與HCV核心區(qū)RNA的相互作用，參與HCVRNA的翻譯和復制。④PGAMB和HCV核心蛋白可以在HEPG2細胞中瞬時表達。

簡介：狂犬病是一種死亡率幾乎達到100％的人畜共患急性傳染病，至今尚無有效的治療方法，唯一的措施就是在病毒暴露前后進行免疫預防。但由于存在疫苗質(zhì)量、保護期、接種時機等問題，致使該病屢有發(fā)生，給人們帶來生命的威脅。本文擬利用RNA干擾技術(shù)，抑制狂犬病病毒在細胞和機體中的復制，為今后進行狂犬病的抗病育種研究工作奠定基礎(chǔ)。首先根據(jù)狂犬病病毒的全長基因信息，利用計算機軟件，選擇了分別針對狂犬病病毒的N核蛋白基因、P磷蛋白基因和LRNA聚合酶基因基因的4個SIRNA靶序列，隨后合成了相應的8條寡核苷酸單鏈，將兩兩互補的寡核苷酸單鏈經(jīng)退火形成SIRNA基因，克隆到PSTRIKEU6載體上，構(gòu)建了表達SIRNA的4種質(zhì)粒，分別為PU6SISTRIKETN1、PU6SISTRIKEP2、PU6SISTRIKEL3、PU6SISTRIKEL4，經(jīng)PCR檢測及測序結(jié)果證明，序列正確。在細胞水平上，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將構(gòu)建的4個表達載體，分別轉(zhuǎn)染BHK21細胞，用濃度為1000ΜGML的G418進行篩選。PCR和IRTPCR實驗都證明，表達質(zhì)粒已經(jīng)轉(zhuǎn)染進BHK21細胞，成功獲得了穩(wěn)定表達SIRNA的單克隆細胞株。用TCID1025ΜL的病毒經(jīng)10倍倍比稀釋后對細胞進行接毒，細胞病變結(jié)果表明，未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的對照細胞與1～4號穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞出現(xiàn)CPE的病毒最大稀釋度分別為10、10、10、10、10，可見4種篩選的穩(wěn)定細胞株較對照細胞，接毒后病毒毒力明顯降低；病毒空斑形成試驗證明，加入稀釋度為10的病毒液后，對照細胞的PFU為1002ML，1～4號穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的PFU分別為1002ML、1002ML、1002ML、1002ML，可見穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株上病毒滴度都有所降低，1號和4號細胞上病毒滴度降低尤為明顯最后，用篩選的穩(wěn)定細胞株分別培養(yǎng)病毒，收獲病毒液，進行乳鼠腦內(nèi)接毒，1～4號病毒與正常細胞病毒對乳鼠的LD分別為10002ML、10002ML、10002ML、10002ML和10002ML。由此可知，1～4號穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株培養(yǎng)的病毒較正常細胞培養(yǎng)的病毒對乳鼠的LD明顯降低，1號和4號的病毒液LD降低更明顯，與病毒空斑形成試驗結(jié)果相一致。因此，細胞實驗結(jié)果表明，RNAI對狂犬病病毒的復制有明顯的抑制效應。在小鼠個體水平上，通過卵巢注射法，將質(zhì)粒注射到性成熟的母鼠卵巢中，然后將其與性成熟的公鼠合籠，懷孕后產(chǎn)下仔鼠，共獲得仔鼠85只。PCR檢測仔代小鼠的基因組，共獲得陽性小鼠32R，陽性率N364％。結(jié)果表明，SIRNA基因已經(jīng)成功整合入染色體中。但測序結(jié)果表明，整合的SIRNA基因部分出現(xiàn)堿基突變，其具體原因還在進一步分析中。綜上結(jié)果，本研究證實了表達SIRNA的質(zhì)粒載體所產(chǎn)生的RNAI效應對狂犬病病毒的復制有明顯的抑制作用，為利用RNAI技術(shù)來防治狂犬病提供了依據(jù)。

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簡介：人纖溶酶原K5重組腺病毒的構(gòu)建及其功能研究CONSTRUCTIONANDFUNCTIONRESEARCHOFHUMANPLASMINOGENKRINGLE5RECOMBINANTADENOVIRUS專業(yè)生物化學與分子生物學碩士研究生劉杏導師高國全教授本課題獲國家自然科學基金教育部新世紀人才基金廣東省科技計劃項目重大專項廣東省自然科學基金團隊項目廣州市科技攻關(guān)重點項目2007年5月廣州資助摘要方法12367結(jié)果第一部分K5病毒骨架的構(gòu)建根據(jù)K5的序列設計特異性引物，將其重組進入PDISPLAY質(zhì)粒用以獲取PDISPLAY質(zhì)粒中的真核信號肽序列；測序鑒定重組質(zhì)粒；根據(jù)K5的序列設計特異性引物，分別克隆出不帶信號肽的K5與攜帶信號肽的SPK5基因片段真核信號肽序列來源于PDISPLAY質(zhì)粒，將其重組進入腺病毒穿梭質(zhì)粒構(gòu)建重組體；測序鑒定重組質(zhì)粒；將穿梭質(zhì)粒與ADEASY一1質(zhì)粒PMEI線性化后在大腸桿菌BJ5183中同源重組；將上述同源重組質(zhì)粒PAEI線性化后獲得三種病毒骨架ADK5、ADSPK5與ADCONTROL，純化滅菌；酶切和PCR鑒定病毒骨架。1DNA序列分析顯示穿梭質(zhì)粒構(gòu)建正確；2酶切鑒定證明同源重組成功，PCR鑒定證明病毒骨架中攜帶有目的基因。方法L234567第二部分重組腺病毒的包裝純化與功能實驗脂質(zhì)體包裹法將上述三種純化滅菌的病毒骨架DNA導入293A細胞中，包裝病毒；觀察GFP的表達情況；810日左右凍融法裂解細胞，獲取原代病毒液；用原代病毒液感染293細胞，大量擴增病毒；CSCI梯度離心純化病毒液感染HELA細胞、肝細胞，內(nèi)皮細胞等觀察病毒感染能力；WESTERNBLOT檢測病毒攜帶的K5基因表達情況；Ⅱ

簡介：目的選擇HCMVPP65基因中能激發(fā)CTL和B細胞免疫的優(yōu)勢抗原表位基因PP6510871515NT基因片段，PCR擴增片段，構(gòu)建表達載體并在原核細胞中進行功能性表達，進一步鑒定表達蛋白的抗原性；構(gòu)建酵母PPIC9KPP65真核表達載體。方法參考PET21A載體序列多克隆位點，根據(jù)PP6510871515NT基因序列設計引物，堿性質(zhì)粒抽提法提取含有HCMVPP65全長基因的PGEMTPP65質(zhì)粒，通過聚合酶鏈反應PCR獲得目的PP6510871515NT基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)BAMHⅠ和XHOⅠ雙酶切、T4連接酶連接、藍白斑篩選構(gòu)建PET21APP65質(zhì)粒；經(jīng)酶切鑒定及核酸序列測定后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21DE3誘導表達；表達的蛋白進行SDSPAGE電泳并經(jīng)WESTERNBLOT鑒定PP65融合蛋白的抗原性；包涵體蛋白經(jīng)過復性純化包被聚苯乙烯微量反應板，ELISA法檢測PP65融合蛋白的抗原性。參考PPIC9K載體序列多克隆位點，根據(jù)PP6510871515NT基因序列設計引物，以PGEMTPP65質(zhì)粒為摸板，PCR獲得目的PP6510871515NT基因。PCR產(chǎn)物與PMD19TSIMPLE載體連接，藍白斑篩選構(gòu)建的PMD19TSIMPLEPP65質(zhì)粒，經(jīng)酶切、測序鑒定后，以SNABⅠ和BLNⅠ酶切PMD19SIMPLEPP65質(zhì)粒和PPIC9K載體，T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化至DH5Α感受態(tài)細胞。結(jié)論構(gòu)建了穩(wěn)定的PET21APP65原核表達體系，獲得了具有活性、純度較高的PP65蛋白片段，此外也成功構(gòu)建了酵母表達載體PPIC9KPP65，為大量制備活性PP65蛋白片段、HCMV感染檢測試劑的研發(fā)和HCMV亞單位疫苗制備提供基礎(chǔ)，也為進一步研究PP65的生物學功能奠定實驗基礎(chǔ)。

簡介：●■蘭州大學博士學位論文載體轉(zhuǎn)染EJ和T24細胞72小時后，其轉(zhuǎn)染效率均50％以上。CDC42的下調(diào)導致腫瘤細胞形態(tài)學改變，主要表現(xiàn)為細胞變圓。3用PSIHH1CDC42SHRNA轉(zhuǎn)染后，CDC42MRNA和蛋白質(zhì)的表達逐漸減少。轉(zhuǎn)染72小時后，其MRNA和蛋白質(zhì)的表達在EJ細胞分別下降89％和81％，在T24細胞分別下降90％和85％，而PSIHHILACIFERASESHRNA轉(zhuǎn)染的兩種細胞CDC42基因表達沒有明顯改變。4CDC42沉默能顯著減少兩種膀胱癌細胞磷酸化STAT3蛋白水平，但STAQ3MRNA和總S“A3蛋白質(zhì)水平與對照組相比沒有改變。5與對照組相比，CDC42沉默后，T24和EI細胞的增殖能力顯著下降。而且CDC42下調(diào)也能顯著減少S期細胞的百分率FJ細胞減少712％，T24細胞減少48O％，GL期細胞百分率相應增加。6HOECHST33258染色EJ細胞后，發(fā)現(xiàn)CDC42沉默能使細胞核碎片增加并出現(xiàn)凋亡小體，而DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳中亦發(fā)現(xiàn)典型的DNA梯狀現(xiàn)象。此外，CDE42沉默能顯著減少腫瘤細胞與胞外基質(zhì)粘附的能力EL細胞減少653％，T24細胞減少745％。結(jié)論構(gòu)建的靶向CDC42的慢病毒載體質(zhì)粒在兩種膀胱癌細胞中能有效地下調(diào)CDC42MRNA和蛋白質(zhì)的表達、導致細胞形態(tài)學改變、抑制細胞生長、誘導細胞凋亡、減少細胞粘附以及下調(diào)S1弼的磷酸化。這些資料表明RNAI介導的CDC42沉默可能是膀胱腫瘤基因治療的一種新途徑。關(guān)鍵詞RNA干擾；小干擾RNA；短發(fā)夾RNA；CDC42；RHOGTP酶；膀胱癌；STAT3；凋亡；粘附；生長；增殖；慢病毒載體

簡介：登革病毒DENGUEVIRUS，DEN作為世界上最重要的人類蟲媒病毒之一已經(jīng)威脅到熱帶和亞熱帶超過100個國家的25億人口。登革病毒一般情況下導致登革熱DENGUEFEVER，DF，但是部分病人可以進展為登革出血熱DENGUEHEMRHAGICFEVER，DHF和登革休克綜合征DENGUESHOCKSYNDROME，DSS。DHF和DSS的發(fā)病機制尚未清楚，一般認為主要是由于病毒和宿主相互作用而介導。DHFDSS為重癥的登革病毒感染，其主要的特征之一是血漿滲漏。DF進展到DHFDSS的過程尚未闡明，目前普遍認為DHFDSS發(fā)病機制包括登革血清型間的交叉免疫反應、病毒的毒力以及感染后產(chǎn)生的抗體依賴增強ADE效應在DHFDSS的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。一些免疫效應分子參與其病理機制。細胞因子水平尤其是腫瘤壞死因子TUMNECROSISFACT，TNF和一些化學介質(zhì)的快速升高在DHFDSS發(fā)病中起到了重要的作用，引起一系列相應的臨床表現(xiàn)，如血漿外滲、休克、出血等。2而作為DHFDSS發(fā)病中最重要的靶點血管內(nèi)皮細胞在登革病毒感染后又出現(xiàn)怎樣的變化呢為了更好地揭示這個問題，本課題組用AFFYMETRIXHUMANGENOMEU133PLUS20芯片研究登革病毒感染血管內(nèi)皮細胞后基因表達譜的變化?；蛐酒夹g(shù)是伴隨著人類基因組工程而興起的一門嶄新的技術(shù)，是一項專業(yè)基因分析技術(shù)，主要包括分析基因序列、檢測基因突變和診斷疾病基因。基因芯片技術(shù)能夠檢測成千上萬基因的表達水平。通過分析這些數(shù)據(jù)，我們能夠全面了解登革病毒感染中各種基因表達的變化及其相應功能，為進一步研究這些基因與疾病之間的關(guān)系提供依據(jù)。3通過全面分析基因芯片結(jié)果，我們對登革病毒感染血管內(nèi)皮細胞前后的基因表達變化有了全面和較為深刻的認識。目的本研究旨在全面了解血管內(nèi)皮細胞在登革病毒感染后基因水平的變化。內(nèi)容和方法1原代人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞HUMANUMBILICALVEINENDOTHELIALCELLS，HUVEC的分離、培養(yǎng)、鑒定取新鮮臍帶分離、培養(yǎng)原代HUVEC。采用Ⅷ因子抗原免疫組織化學技術(shù)鑒定所分離的細胞。用生長穩(wěn)定，形態(tài)良好的第二至第四代細胞進行實驗。2芯片實驗通過總核糖核酸RIBONUCLEICACID，RNA的提取和純化，互補脫氧核糖核酸COMPLEMENTARYDEOXYRIBONUCLEICACID，CDNA的合成和純化，體外轉(zhuǎn)錄INVITROTRANION，IVT合成互補核糖核酸COMPLEMENTARYRIBONUCLEICACID，CRNA和CRNA的純化，CRNA片段化、配制雜交液，芯片雜交，洗脫芯片，掃描芯片過程來完成芯片制作。3基因芯片數(shù)據(jù)分析采用專業(yè)芯片分析軟件和相關(guān)網(wǎng)站對結(jié)果進行分析。4實時定量PCRREALTIMEQUANTITATIVEPCR，QRTPCR實驗通過設計引物，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應，熒光定量PCR等步驟來完成實時定量PCR的實驗。結(jié)果1本研究共分離3個標本，每個標本均分為感染與未感染兩個組，共6張芯片。采用配對T檢驗分析感染組與未感染組間差異篩選出干擾素Α誘導蛋白6INTERFERON，ALPHAINDUCIBLEPROTEIN6，IFI6，干擾素誘導的跨膜蛋白1INTERFERONINDUCEDTRANSMEMBRANEPROTEIN1，IFITM1等共846個差異基因。目前有確定基因名稱的共有556個，其中上升的有299個基因，下降的基因有257個基因。2經(jīng)分析差異基因主要參與如下幾條通路促性腺激素釋放激素信號通路，細胞外基質(zhì)受體的相互作用，粘附途徑，ATP結(jié)合盒ATPBINDINGCASSETTE，ABC運載體，長時程增效作用，白細胞遷移作用，谷氨酸代謝，鈣信號通路，氮代謝通路。3經(jīng)分析差異基因的基因本體GENEONTOLOGY，GO富集于以下幾個方面免疫過程，免疫應答，配體依賴的核受體，終端紐，軸突組成部分，質(zhì)膜組成部分，類固醇激素受體，體液平衡的調(diào)節(jié)。4實時定量PCR結(jié)果顯示干擾素Α誘導蛋白27INTERFERON，ALPHAINDUCIBLEPROTEIN27，IFI27，干擾素誘導蛋白44INTERFERONINDUCEDPROTEIN44，IFI44，IFITM1，干擾素誘導的17KD蛋白INTERFERONINDUCED17KDAPROTEIN，ISG15，IFI6這五個基因與芯片結(jié)果的趨勢一致，均顯示DEN感染組較未感染組表達升高。而在非差異基因的實時定量PCR結(jié)果中顯示X連鎖凋亡抑制蛋白相關(guān)因子1XLINKEDINHIBITOFAPOPTOSISASSOCIATEDFACT1，XAF1，信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子1SIGNALTRANSDUCERSACTIVATSOFTRANIONL，STAT這兩個基因表現(xiàn)為感染組相對于未感染組呈上升趨勢，細胞分裂周期蛋白20CELLDIVISIONCYCLE20HOMOLOG，CDC20，基質(zhì)金屬蛋白酶14MATRIXMETALLOPEPTIDASE14，MMP14，小窩蛋白2CAVEOLIN2，CAV2這三個基因在實時定量結(jié)果中表達量均無大的變化。趨化因子CXC基序受體4CHEMOKINECXCMOTIFRECEPT4CXCR4，干擾素誘導蛋白P78MYXOVIRUSRESISTANCE1，MX1，干擾素調(diào)節(jié)因子7INTERFERONREGULATYFACT7，IRF7表達量過低，超出檢測范圍。結(jié)論1登革病毒感染HUVEC后可引起多個基因表達發(fā)生改變，其中干擾素誘導相關(guān)蛋白的基因表達有較大幅度的變化，這說明干擾素相關(guān)蛋白可能在登革病毒感染HUVEC過程中發(fā)揮了重要的作用。但由于干擾素誘導蛋白功能各異，其在登革病毒感染HUVEC過程中的作用極其復雜。2基因組芯片技術(shù)可以在人類全基因組水平上大規(guī)模篩選基因，是研究疾病發(fā)病機制的有力工具。