簡(jiǎn)介：山東大學(xué)碩士學(xué)位論文病毒唑?qū)Σ《拘孕募⊙庄熜Ъ皺C(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究姓名姜宏磊申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專(zhuān)業(yè)兒科心血管指導(dǎo)教師韓秀珍張建軍20050512山東大學(xué)碩士學(xué)位論文病毒唑?qū)Σ《拘孕募⊙庄熜Ъ皺C(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究專(zhuān)業(yè)兒科心血管研究生姜宏磊導(dǎo)師韓秀珍教授張建軍副教授中文摘要研究背景和目的病毒性心肌炎VIRALMYOCARDITIS，VM是兒科常見(jiàn)的后天性心血管疾病之一，可由多種病毒引起，其中柯薩奇病毒B組COXSACKIEVIRUSB，CVB最常見(jiàn)，約占50％以上。其病理變化主要是心肌廣泛或散在的細(xì)胞壞死及周?chē)g質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)。近年來(lái)此病發(fā)病率有所增多，大多數(shù)患者可以完全恢復(fù)正常心功能，少數(shù)患者臨床癥狀可以改善但會(huì)遺留心功能不全，少數(shù)患者進(jìn)行性心臟擴(kuò)大，慢性心力衰竭、死亡或需要心臟移植。該病發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明，一般認(rèn)為病毒的直接損傷作用和免疫異常包括病毒誘導(dǎo)的免疫和自身免疫反應(yīng)參與了病毒性心肌炎的發(fā)病過(guò)程。因此，病毒性心肌炎的治療重點(diǎn)一是抗病毒治療，二是阻斷免疫反應(yīng)對(duì)心肌細(xì)胞的損害。但對(duì)該疾病至今尚無(wú)特效療法。本研究以柯薩奇病毒B3腹腔注射純系BALB／C小鼠，制備VM模型，來(lái)探討病毒唑?qū)M小鼠的作用機(jī)制和療效。材料與研究方法；取120只4周齡BALB／C健康雄性小鼠，體重為15～20克，用隨機(jī)數(shù)字法均分為3組，每組40只，包括空白對(duì)照組A組、病毒對(duì)照組B組、病毒唑治療組C組，B、C組每只小鼠均腹腔接種NANCY株CVB3病毒液O2ML1075TCID50／M1A組小鼠腹腔接種不含病毒的EAGLE’S液02ML。C組小鼠接種病毒后24小時(shí)丌始給病毒唑03MG／GD，每R2次灌胃，A、B組給生理鹽水O15ML。每日2次灌胃。接種病毒后7、14、2L天各分別處死LO只墑眼球

簡(jiǎn)介：碩士學(xué)位論文乙型肝炎病毒全基因組Y897383轉(zhuǎn)基因小鼠病毒蛋白表達(dá)模式的研究SLUDYONPROTEINEXPRESSIONPALLEMINTRANSGENICMICEHARBOUNGHBVGENOMICDNA研究生指導(dǎo)小組張南胡以平教授張樹(shù)忠副教授學(xué)曉淵講師第二軍醫(yī)大學(xué)細(xì)胞生物教研室，二OO六年五月中文摘要本課題通過(guò)對(duì)我們實(shí)驗(yàn)室建立的全基因組乙肝轉(zhuǎn)基因小鼠C57一TGNHBVADR20SMMU“3號(hào)”品系在不同發(fā)育階段的病毒轉(zhuǎn)錄水平、病毒蛋白表達(dá)水平、肝臟病理學(xué)變化和體液免疫對(duì)肝細(xì)胞損傷作用的研究，得出以下結(jié)論該品系轉(zhuǎn)基因小鼠能夠在肝臟穩(wěn)定表達(dá)HB啦G和HBCAG，病毒蛋白表達(dá)量無(wú)性別差異，病毒蛋白表達(dá)水平和轉(zhuǎn)錄水平無(wú)相關(guān)性。小鼠肝臟可產(chǎn)生類(lèi)似慢性無(wú)癥狀HBV攜帶者的病理學(xué)變化，病理改變的程度和肝臟HBSA譬的表達(dá)量無(wú)相關(guān)性。向小鼠體內(nèi)注射HBV病毒蛋白的單克隆抗體能夠誘發(fā)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生輕微的病理?yè)p傷，但無(wú)血清轉(zhuǎn)氨酶水平的變化?？贵w注射量的變化對(duì)肝臟的損傷程度沒(méi)有影響。本研究證明該品系轉(zhuǎn)基因小鼠生物學(xué)性狀穩(wěn)定，可以作為生物醫(yī)藥研究的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，用于抗乙肝病毒新藥的篩選及其安全性的評(píng)價(jià)。關(guān)鍵詞乙型肝炎病毒；轉(zhuǎn)基因小鼠；蛋白表達(dá)；病理學(xué)；單克隆抗體ABSTRACT1NTHISSTUDYWEANALYZEDME1EVELOFHBVTRANSCRIPTION，THEPATTEMOFHBVPROTEINEXPRESSIONANDPATHOLO西CCHANGESINLIVERINTHETRANSGENICMOUSELINEC57’11E業(yè)呵HBVHDR20SMMU3DEVELOPMENTALLYWBALSOINVESTIGATEDTHELIVERINJURYWASINDUCEDBYHUMORALIMMUNITYTLLROU曲THESTUDV，WECONCLUDETHATTHEEXPRESSIONOFHBSAGANDHBCAGINLIVERINTHISMOUSELINEISPERSISTENTAILDSTABLENOCORRELATIONWASDETECTEDBET’ⅣEENPMTEINEXPRESSIONANDTRANSCRIPTIONLEVELOFHBSAGINSAMEMICEATSAMEDEVELOPMENTTIMET1LEREISNOOBVIOUSDI矗ERENCEINTHEHBSAGANDHBCAGEXPRESSIONIN1JVERBETWEENMALEAJLDFCMALEINTHETRANSEENICMICEIT’SSHOWNCHRONIC1ESIONINLIVERASCLLL0NICASYMPTOMATICHBVCAIRIERANDTHEREWASNOPARAILELRELATIONBETWEENHEPATOCYTEDAMAGEANDEXPRESSIONOFVIMSPMTEJNSINTHESEMICELIVERINJURYWASINDUCEDBYTHEHUMORAIIMMUNEREACTIONINTHETRANSGENICMICE，BUTTHEDAMAGEWASSOSLI曲TTHATMEMICECANSELFCURETHE1EVELOFAITANDASTHADNOOBVIOUSDIFFERCNCEBETWEENⅡO加ALANDTRANS窟EⅡICMICETHEBIOLO西CALCHARACTERISTICSOFC57TGNHBVHDF2OSMMU3TRANS疊ENICMICEISBETTERIOBEALABORATORYANJMALMODELWHICHCANBEUSEDINTHESTUDVOFRELATIONSHIPBETWEENHBVANDIT’SHOSCAILDEVALUATINGTHESECURITYOFHBVANTIVJMSDMGSANDVACCJNEKEYWORDSHEPATITJSBV打US，TRANSGENICMICE，PROTEINEXPRCSSION，PATHOIOGY，MONOCLONALANTIBODY

簡(jiǎn)介：狂犬病毒RV是狂犬病的病原體，它具有廣泛的動(dòng)物宿主，可以引起人和多種動(dòng)物致死性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，以恐水、畏光、吞咽困難、狂躁等臨床表現(xiàn)為特征。全世界每年約有5萬(wàn)人死于狂犬病，我國(guó)每年約有上千人死于狂犬病。RV表面抗原蛋白GP是一種跨膜糖蛋白，構(gòu)成了病毒表面突起，是狂犬病毒與細(xì)胞受體結(jié)合的結(jié)構(gòu)，在狂犬病毒致病和免疫中起著關(guān)鍵作用。為此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RTPCR從狂犬病毒AG株基因組RNA中擴(kuò)增得到GP基因全序列，利用基因工程技術(shù)插入到真核外源蛋白表達(dá)的載體PCIDHFR中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒PCIGP，以脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染至CHODHFR細(xì)胞中，MTX篩選出的抗性克隆表達(dá)了GP蛋白，對(duì)其抗原性進(jìn)行了初步的研究。ELISA、WESTERNBLOT和免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該蛋白具有良好的抗原性，可以被血清中特異的抗GP單抗所識(shí)別。本實(shí)驗(yàn)初步建立了CHO表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)狂犬病毒GP蛋白的技術(shù)，為研制狂犬病毒基因工程疫苗打下了良好基礎(chǔ)。

簡(jiǎn)介：第一部分細(xì)菌內(nèi)同源重組構(gòu)建含HNGFΒ基因的腺病毒質(zhì)粒目的細(xì)菌內(nèi)同源重組制備含HNGFΒ基因的重組腺病毒質(zhì)粒，在293細(xì)胞內(nèi)包裝后純化重組腺病毒。方法將HNGFΒ外源性核酸片段插入到經(jīng)XMAⅠ與XBAⅠ酶切的PBLUEⅡSK，構(gòu)建成轉(zhuǎn)移質(zhì)粒PBLUEⅡSKHNGFΒ，將其經(jīng)KPNⅠ和NOTⅠ雙酶切后，與經(jīng)同樣雙酶切的穿梭質(zhì)粒PSHUTTLECMV定向重組，構(gòu)建成穿梭質(zhì)粒PSHUTTLECMVHNGFΒ，將該穿梭質(zhì)粒經(jīng)PMEⅠ酶切后，轉(zhuǎn)化含腺病毒骨架質(zhì)粒PADEASY1的感受態(tài)菌BJ5183，重組為PADEASY1HNGFΒ，酶切鑒定正確后，用LIPOFECT介導(dǎo)轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞，包裝為重組腺病毒ADHNGFΒ后用PCR鑒定。透析純化后的腺病毒采用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行滴度測(cè)定。結(jié)果線性化的PSHUTTLECMVHNGFΒ轉(zhuǎn)化含PADEASY1的感受態(tài)菌BJ5183，24H后獲得了30％陽(yáng)性重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切得到一條大于20KB的大片段和一條45KB的特征性條帶，PCR擴(kuò)增出731BP片段。純化后測(cè)得滴度為2241012OPUL。結(jié)論應(yīng)用細(xì)菌內(nèi)同源重組能快速構(gòu)建含HNGFΒ基因的重組腺病毒載體PADEASY1HNGFΒ，酶切鑒定，包裝為高滴度的重組腺病毒ADHNGFΒ，為HNGFΒ基因的應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。第二部分ADHNGFΒ在原代培養(yǎng)的脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)及其生物活性的研究目的以體外培養(yǎng)新生SD大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞為靶細(xì)胞，證明其能表達(dá)有生物活性的目的基因產(chǎn)物，觀察前期所重組的ADHNGFΒ對(duì)靶細(xì)胞的存活及毒性作用，為下一步的在體研究打下基礎(chǔ)。方法從新生SD大鼠的脊髓組織中分離星形膠質(zhì)細(xì)胞ASTROCYTE，AST，應(yīng)用DMEMF121∶1培養(yǎng)基進(jìn)行原代培養(yǎng)及擴(kuò)增，用膠質(zhì)原纖維酸性蛋白GFAP免疫熒光法進(jìn)行鑒定。用重組腺病毒ADHNGFΒMOI為100轉(zhuǎn)染AST后，用免疫組化法，初步測(cè)定培養(yǎng)3天時(shí)ADHNGΒ的表達(dá)情況；用ELISA方法測(cè)定培養(yǎng)3D、6D及9D時(shí)，培養(yǎng)上清中NGFΒ的含量；用噻唑藍(lán)MTT比色法測(cè)定細(xì)胞OD570值，分析細(xì)胞對(duì)ADHNGFΒ的敏感性；用流式細(xì)胞儀對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行倍體分析，觀察對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。結(jié)果從新生SD大鼠的脊髓組織中成功分離培養(yǎng)出星形膠質(zhì)細(xì)胞，GFAP免疫熒光陽(yáng)性。脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞可被ADHNGFΒ感染并表達(dá)HNGFΒ；試驗(yàn)組HNGFΒ表達(dá)量與對(duì)照組同期相比，均有顯著差異，P＜001；并且隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，HNGFΒ表達(dá)量下降，第9天與前兩次比均有顯著差異，P＜001。經(jīng)噻唑藍(lán)測(cè)定，試驗(yàn)組MTT的吸光值OD570與對(duì)照組比有顯著差異，P＜001。流氏細(xì)胞儀測(cè)得細(xì)胞凋亡與MTT結(jié)果同步。結(jié)論ADHNGFΒ能在原代培養(yǎng)的脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，表達(dá)高峰時(shí)間約在第三天。MOI為100時(shí)無(wú)明顯細(xì)胞毒作用，且能夠增加細(xì)胞活性。第三部分鞘內(nèi)注射ADHNGFΒ對(duì)神經(jīng)痛作用的研究目的研究鞘內(nèi)注射ADHNGFΒ對(duì)CCI大鼠疼痛的影響及機(jī)制。方法建立CCI動(dòng)物模型后，隨機(jī)分為Ⅰ組CCI術(shù)后立即L5～L6處鞘內(nèi)注射ADHNGFΒ；Ⅱ組CCI術(shù)后立即L5～L6處鞘內(nèi)注射人工腦脊液ACSF；Ⅲ組假手術(shù)組，除不行坐骨神經(jīng)結(jié)扎外，其它同Ⅱ組。測(cè)定術(shù)前、術(shù)后每4日各組大鼠足底熱痛閾、機(jī)械痛閾值最終結(jié)果以手術(shù)側(cè)非手術(shù)側(cè)的比值表示及行為學(xué)評(píng)分。分別于術(shù)后4天、7天、14天、28各天取8只動(dòng)物麻醉后，4只灌注固定，取L4～L6段脊髓，免疫組化法測(cè)定脊髓背角痛物質(zhì)SP、CGRP的變化；另4只不灌注固定，麻醉后直接斷頭處死，冰上快速取L4～L6脊髓勻漿后ELISA法測(cè)定HNGFΒ的含量。結(jié)果所有CCI動(dòng)物術(shù)后0～28天均出現(xiàn)痛覺(jué)過(guò)敏，出現(xiàn)明顯的疼痛行為學(xué)改變和熱痛閾、機(jī)械痛閾的降低。CCI術(shù)后立即鞘內(nèi)注射ADHNGFΒ動(dòng)物自術(shù)后第4天開(kāi)始熱痛敏明顯減輕，與同一時(shí)點(diǎn)CCIACSF組比，P＜005；整體疼痛行為學(xué)有所改善，但無(wú)顯著差異；機(jī)械痛敏無(wú)明顯改變。同時(shí)，注射ADHNGFΒ動(dòng)物術(shù)后第4～28天脊髓HNGFΒ明顯升高，與術(shù)前比，P＜001；術(shù)側(cè)脊髓背角SP較ACSF組明顯減少，P＜001或P＜005；CGRP無(wú)明顯改變。結(jié)論CCI術(shù)后立即L5L6處鞘內(nèi)注射ADHNGFΒ可明顯減輕熱痛敏，該改變與HNGFΒ在脊髓表達(dá)增加和SP表達(dá)減少有關(guān)。

簡(jiǎn)介：中山大學(xué)博士學(xué)位論文葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78基因多態(tài)性與乙型肝炎病毒、原發(fā)性肝細(xì)胞癌易感性和預(yù)后的相關(guān)性研究姓名朱蕭申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別博士專(zhuān)業(yè)生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師孔祥復(fù)20090603葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78基因多態(tài)性與乙型肝炎病毒、原發(fā)性肝細(xì)胞癌易感性和預(yù)后的相關(guān)性研究的關(guān)系。2材料和方法410份華南地區(qū)健康漢族人的基因組GRP78基因的PCR產(chǎn)物直接被測(cè)序，包括了該基因的啟動(dòng)子區(qū)、所有的外顯子區(qū)、3’非翻譯區(qū)3’UNTRANSLATEDREGION，3’UTR，和大部分的內(nèi)含子。在年齡和性別上與正常對(duì)照組相匹配的392份HBV感染組和428份HCC組，針對(duì)所發(fā)現(xiàn)的SNPS，在熒光定量PCR儀ABIPRISM7900HT，APPLIEDBIOSYSTEMS，F(xiàn)OSTERCITY，CA上使用TAQMANMGBPROBES基因分型技術(shù)，或使用測(cè)序技術(shù)進(jìn)行基因分型。連鎖不平衡LINKAGEDISEQUILIBRIUM，LD和單體型HAPLOTYPES的構(gòu)建使用HAPLOVIEWVERSION32。雙體型DIPLOTYPES的構(gòu)建通過(guò)以最大期望值EXPECTATIONMAXIMIZATIONEM算法為基礎(chǔ)的PENHAPLO程序?qū)崿F(xiàn)。HBV感染的血清學(xué)標(biāo)記物的檢驗(yàn)通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附檢驗(yàn)ENZYME1INKEDIMMUNOSORBENTASSAYELISA或常規(guī)化學(xué)檢驗(yàn)。HBVDNA的定量通過(guò)使用商品化的HBV熒光定量PCR診斷試劑盒SHENZHENPGBIOTECH，CHINA，并在LIGHTCYCLERTMSYSTEMSROCHEDIAGNOSITC，ROTKREUZSWITZERLANDK進(jìn)行。通過(guò)GENEPOPVERSION40遺傳軟件檢驗(yàn)對(duì)照組及疾病組基因型分布的HARDYWEINBERG平衡。CHISQUARE檢驗(yàn)被用在疾病組和對(duì)照組在性別、吸煙和飲酒習(xí)慣上的可能差異。而他們?cè)谀挲g上的可能差異使用MANNWHITNEYU檢驗(yàn)。疾病組和對(duì)照組或不同疾病組之間在等位基因、基因型、單體型和雙體型水平上的差異，使用校正了年齡、性別、吸煙和飲酒習(xí)慣的無(wú)條件LOGISTIC回歸模型，同時(shí)計(jì)算優(yōu)勢(shì)比ODDSRATIOS，OR和95％的可信區(qū)間CONFIDENCEINTERVALS，CIS。HBV組中，血清HBVDNA的水平與等位基因、基因型、單體型和雙體型的聯(lián)系，使用單因素的方差分析ONEWAYANALYSISOFVARIANCE，ANOVA和BONFERRONI檢驗(yàn)。所有的統(tǒng)計(jì)都是雙側(cè)檢驗(yàn)。以尸值小于005或小于保守性的閾值為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。保守性閾值是根據(jù)SNPS之間的連鎖不平衡關(guān)系，由SNPSPDPROGRAM校正而來(lái)。HCC病人的隨訪中位數(shù)時(shí)間是28個(gè)月從6到60個(gè)月。數(shù)據(jù)的收集來(lái)自于至少以下的一點(diǎn)住院病例記錄，和直接聯(lián)系病人或其家屬。從HCC的最初確診日期到病人的死亡日期是總的生存時(shí)間OVERALLSURVIVAL，OS。病人生存到隨訪的最后一日，則生存時(shí)間被當(dāng)作截尾CENSORED值。隨訪的結(jié)束日期是2008II

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簡(jiǎn)介：目的異基因混合嵌合體能誘導(dǎo)受者對(duì)供者移植器官特異耐受，從而能夠避免器官移植后長(zhǎng)期運(yùn)用免疫抑制藥物。但是，迄今為止還沒(méi)有一種安全高效的異基因混合嵌合體誘導(dǎo)方案可供臨床運(yùn)用。在不對(duì)受體清髓處理的情況下，本研究探討運(yùn)用重組腺病毒ADCTLA4FASL聯(lián)合供者骨髓移植方案能否誘導(dǎo)混合嵌合體和同種皮膚移植耐受，同時(shí)探討免疫抑制藥物對(duì)該方案誘導(dǎo)的混合嵌合耐受的影響。方法1運(yùn)用ADEASY系統(tǒng)重組腺病毒ADCTLA4FASL，酶切、PCR、WESTERNBLOT鑒定。2將BALBCH2D小鼠皮膚移植于C57BL6H2B，B6小鼠，同時(shí)經(jīng)尾靜脈注射BALBC小鼠骨髓細(xì)胞和腺病毒ADCTLA4FASL；運(yùn)用ELISA檢測(cè)CTLA4FASL融合蛋白在血漿中的表達(dá)，組織學(xué)分析了解該融合蛋白的肝細(xì)胞毒性，F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗H2D單抗對(duì)受體小鼠外周血白細(xì)胞標(biāo)記后進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)異基因嵌合水平，觀察皮膚移植物存活情況，運(yùn)用有限稀釋混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)方法估計(jì)輔助性T淋巴細(xì)胞前體HTLP和細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞前體CTLP的頻數(shù)。3將BALBCH2D小鼠皮膚移植于C57BL6H2B，B6小鼠，同時(shí)經(jīng)尾靜脈注射BALBC小鼠骨髓細(xì)胞和腺病毒ADCTLA4FASL，術(shù)后4周每天注射環(huán)孢素ACSA或霉酚酸酯MMF；然后觀察移植皮膚存活情況，通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定受體外周血VΒ11的T細(xì)胞的水平和供體來(lái)源細(xì)胞的嵌合水平，通過(guò)單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)了解對(duì)供體抗原的耐受狀態(tài)。結(jié)果1重組腺病毒ADCTLA4FASL的DNA通過(guò)PACI酶切證實(shí)為同源重組后的腺病毒，用特異引物經(jīng)PCR證實(shí)含有外源基因CTLA4FASL，WESTERNBOLT表明細(xì)胞感染重組腺病毒ADCTLA4FASL后能表達(dá)分泌性的融合蛋白CTLA4FASL。2腺病毒ADCTLA4FASL能夠在小鼠體內(nèi)表達(dá)CTLA4FASL融合蛋白，持續(xù)約56天左右，且無(wú)明顯肝細(xì)胞毒性。該聯(lián)合方案誘導(dǎo)了持久140D時(shí)供體細(xì)胞＞20％宏嵌合體MACROCHIMERISM；同時(shí)這種嵌合體促進(jìn)了穩(wěn)定的供體特異性耐受，BALBC小鼠的皮膚移植物在B6受體小鼠中長(zhǎng)期存活THEMEANSURVIVALTIMEMST＞200D，而來(lái)源于C3H小鼠的第三者皮膚移植物被該嵌合體小鼠正常排斥。該聯(lián)合方案處理的B6小鼠在接受皮膚移植14天后，輔助性T淋巴細(xì)胞前體HTLP和細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞前體CTLP的頻數(shù)降低到很低的水平，表明ADCTLA4FASL能夠迅速促進(jìn)全面的外周耐受，從而有利于供體骨髓細(xì)胞植入。接受皮膚移植140天后，供體皮膚僅在形成長(zhǎng)期嵌合體的受體小鼠中繼續(xù)存活，這些小鼠體內(nèi)供體特異性的HTLP和CTLP的頻數(shù)減少，提示長(zhǎng)期的皮膚移植物耐受與穩(wěn)定的混合嵌合體有關(guān)，中樞性T細(xì)胞刪除可能是耐受維持的主要機(jī)制。3聯(lián)合方案處理后短期加用免疫抑制藥物均促進(jìn)早期供體骨髓細(xì)胞植入；但單用CSA或CSA與MMF聯(lián)用的受體小鼠在皮膚移植后140D時(shí)混合嵌合降低到很低水平；單用CSA或CSA與MMF聯(lián)用的受體小鼠中供體皮膚平均生存時(shí)間顯著低于不用免疫抑制藥物或用MMF的受體小鼠P＜005；皮膚移植后21D時(shí)CSA或CSA與MMF聯(lián)用的受體小鼠VΒ11的T細(xì)胞水平顯著高于不用免疫抑制藥物或用MMF的受體小鼠P＜005；皮膚移植后150D時(shí)CSA或CSA與MMF聯(lián)用的受體小鼠脾細(xì)胞未顯示對(duì)同種抗原特異性耐受。結(jié)論1成功制備具有完整功能和感染能力的重組腺病毒ADCTLA4FASL。2ADCTLA4FASL聯(lián)合供者骨髓移植方案能誘導(dǎo)穩(wěn)定的混合嵌合體和同種皮膚移植耐受。3CSA或含CSA的免疫抑制方案抑制CTLA4FASL重組腺病毒和供者骨髓移植聯(lián)合方案誘導(dǎo)的混合嵌合耐受，其機(jī)理可能與早期外周供體特異性T細(xì)胞刪除減少有關(guān)；而MMF與該嵌合耐受方案相容。

簡(jiǎn)介：目的光動(dòng)力療法PHOTODYNAMICTHERAPY，PDT為一種應(yīng)用氧分子參與的伴隨生物效應(yīng)的光敏化反應(yīng)進(jìn)行臨床治療的方法。由于其選擇性治療的特點(diǎn)，在腫瘤的綜合治療中日益顯示出重要性，成為腫瘤治療的一項(xiàng)常規(guī)手段。同時(shí)，光動(dòng)力療法也已應(yīng)用于血液凈化，對(duì)血液制品中引起傳染性疾病的病毒進(jìn)行滅活具有很好的效果。在此基礎(chǔ)上，我們針對(duì)該療法進(jìn)行一些初步的研究，期望為滅活病毒提供一種更安全有效的方法。方法1研究血卟啉介導(dǎo)的光動(dòng)力效應(yīng)體外滅殺Ⅰ型單純皰疹病毒的效果。在保證正常細(xì)胞不受光動(dòng)力效應(yīng)影響的前提下，用兩種不同光劑量2JXM2，6JCM2及特定的光敏劑濃度對(duì)體外培養(yǎng)的HSV進(jìn)行處理，照射后將細(xì)胞置于37℃、5％CO2孵育箱培養(yǎng)5天，觀察CPE，并用四唑鹽MTT比色法測(cè)定細(xì)胞成活率。2光動(dòng)力療法對(duì)血液中乙肝病毒的滅活作用。以轉(zhuǎn)移三個(gè)基因片斷的乙肝轉(zhuǎn)基因鼠作為實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象，尾靜脈給藥，將光針埋入尾靜脈進(jìn)行血管內(nèi)照射，功率為5MW，照射時(shí)間為30MIN。觀察照射過(guò)程中小鼠行為狀態(tài)的變化。治療后兩小時(shí)內(nèi)眥取血，應(yīng)用酶聯(lián)免疫檢測(cè)法檢測(cè)光動(dòng)力作用前后血液中乙肝表面抗原的含量。3光動(dòng)力血液照射療法安全性的初步探索。以大鼠作為研究對(duì)象，靜脈注射HPD，進(jìn)行血管內(nèi)激光照射，分時(shí)間段檢測(cè)血常規(guī)及主要血液生化指標(biāo)，分析PDT產(chǎn)生的影響。結(jié)果光動(dòng)力效應(yīng)體外滅殺Ⅰ型單純皰疹病毒的實(shí)驗(yàn)中，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示，實(shí)驗(yàn)組病毒含量與病毒對(duì)照組有顯著性差異。證明光動(dòng)力療法對(duì)單純皰疹病毒有直接滅活作用。光動(dòng)力療法對(duì)血液中乙肝病毒的滅活實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說(shuō)明，血液中表面抗原的數(shù)量有不同程度的下降，光動(dòng)力療法對(duì)血液中乙肝病毒表面抗原具有一定的抑制作用，且表面抗原主要鑲嵌于病毒外衣殼的脂質(zhì)雙層中，在乙肝病毒的致病上起著重要的作用。光動(dòng)力血液照射療法安全性的初步探索實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)血液指標(biāo)相較對(duì)照組有所波動(dòng)，并未超出相應(yīng)于本實(shí)驗(yàn)環(huán)境的正常指標(biāo)范圍?？梢哉J(rèn)為血管內(nèi)照射光動(dòng)力療法對(duì)正常血液血常規(guī)和生化指標(biāo)沒(méi)有產(chǎn)生危害性的影響，但對(duì)各種抗原及因子的作用需要進(jìn)一步分析。結(jié)論在選擇合適的光敏劑劑量和光照射強(qiáng)度的前提下，光動(dòng)力療法在體外能夠有效地滅殺病毒。在血管內(nèi)照射光動(dòng)力治療中，需要選取最佳的藥物濃度、照射強(qiáng)度和照射時(shí)間，既能保證治療效果，同時(shí)也應(yīng)使其對(duì)正常指標(biāo)的影響盡可能最小。

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簡(jiǎn)介：近年來(lái)，糖尿病的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈逐年上升趨勢(shì)，在我國(guó)已成為繼惡性腫瘤和心腦血管疾患之后第三位重要的慢性非傳染性疾病。然而，現(xiàn)有的各種糖尿病的治療措施，均有一定的不足和局限性。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，基因治療為糖尿病治療開(kāi)辟了一條嶄新的途徑。胰島素基因治療可分為生殖細(xì)胞基因治療和體細(xì)胞基因治療兩大類(lèi)，而體細(xì)胞基因治療從方法上又可分為回體轉(zhuǎn)移和體內(nèi)直接轉(zhuǎn)移兩種。由于技術(shù)上及倫理學(xué)上的障礙，生殖細(xì)胞基因治療目前只能用于實(shí)驗(yàn)研究，不能作為用于人類(lèi)的一條治療途徑。而回體轉(zhuǎn)移法選用的靶細(xì)胞均是永生化細(xì)胞系，移植體內(nèi)后可能形成移植瘤，阻礙了其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用。體內(nèi)直接基因轉(zhuǎn)移是基因治療糖尿病的最終目的。目前，利用基因轉(zhuǎn)移載體將胰島素基因直接導(dǎo)入體內(nèi)并使其表達(dá)成熟的胰島素已不是一件困難的事情，關(guān)鍵是在體細(xì)胞非B細(xì)胞中建立受葡萄糖濃度調(diào)控的胰島素分泌功能。另一方面，基因治療中還有一個(gè)不可忽視的關(guān)鍵問(wèn)題就是轉(zhuǎn)移載體的安全性和轉(zhuǎn)染效率。目前，基因治療中常用的轉(zhuǎn)移系統(tǒng)主要包括非病毒載體系統(tǒng)和病毒載體系統(tǒng)兩大類(lèi)。非病毒載體系統(tǒng)雖然具有制備簡(jiǎn)便，免疫原性較低，安全性較高等優(yōu)點(diǎn)，但其轉(zhuǎn)染效率低下、表達(dá)時(shí)間較短，很難進(jìn)一步應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)。而病毒載體系統(tǒng)，尤其是重組腺病毒，因其轉(zhuǎn)染效率高、宿主范圍廣泛、安全性高、易于制備較高滴度等優(yōu)點(diǎn)，正被越來(lái)越多地應(yīng)用于體外的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)和體內(nèi)的基因治療，是目前最常用的基因轉(zhuǎn)移載體之一。我們構(gòu)建了攜帶葡萄糖依賴(lài)性促胰島素多肽GLUCOSEDEPENDENTINSULINOTROPICPOLYPEPTIDE，GIP啟動(dòng)子控制下人胰島素基因的重組腺病毒，體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)染胃腸道K細(xì)胞，使K細(xì)胞獲得受葡萄糖濃度調(diào)控的胰島素表達(dá)、分泌功能，探索一條胰島素轉(zhuǎn)基因治療的有效途徑，為糖尿病的基因治療走向臨床提供實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)。方法我們首先采用細(xì)胞內(nèi)同源重組法構(gòu)建攜帶GIP啟動(dòng)子控制下的人胰島素基因的非增殖型腺病毒ADGIPHLNS，通過(guò)擴(kuò)增和純化獲得病毒濃縮液。在體外實(shí)驗(yàn)中，將病毒以不同的感染復(fù)數(shù)MULTIPLICITYOFINFECTION，MOI轉(zhuǎn)染STC1細(xì)胞，檢測(cè)病毒的感染能力；以放射免疫法測(cè)定MOI100時(shí)重組腺病毒轉(zhuǎn)染不同細(xì)胞、在不同葡萄糖濃度下培養(yǎng)液中胰島素的含量，來(lái)檢測(cè)GIP啟動(dòng)子的細(xì)胞特異性與葡萄糖反應(yīng)性。通過(guò)RTPCR檢測(cè)細(xì)胞中人胰島素基因MRNA的轉(zhuǎn)錄，采用免疫組化與雙重免疫熒光定性檢測(cè)細(xì)胞中胰島素與GIP的共表達(dá)。然后，通過(guò)腸系膜上動(dòng)脈將病毒導(dǎo)入糖尿病大鼠體內(nèi)，觀察病毒轉(zhuǎn)染后糖尿病大鼠血糖、胰島素分泌及體重的變化。結(jié)果經(jīng)PCR鑒定，證實(shí)我們成功構(gòu)建了含有目的基因的重組腺病毒ADGIPHINS。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)腺病毒對(duì)STC1細(xì)胞有較強(qiáng)的感染能力，且以MOI值為100時(shí)轉(zhuǎn)染效率最佳。以重組病毒轉(zhuǎn)染不同細(xì)胞，結(jié)果表明僅在STC1細(xì)胞內(nèi)有胰島素的表達(dá)，且在轉(zhuǎn)染后第3天就進(jìn)入表達(dá)高峰，一直持續(xù)至第七天；同時(shí)發(fā)現(xiàn)胰島素的表達(dá)量隨葡萄糖濃度升高而增加，但差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RTPCR和免疫組化分別從RNA與細(xì)胞內(nèi)蛋白水平驗(yàn)證了轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)有胰島素基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。經(jīng)腸系膜上動(dòng)脈注入重組病毒，可以成功地轉(zhuǎn)染糖尿病大鼠腸道的K細(xì)胞，使其產(chǎn)生血糖可調(diào)節(jié)性胰島素分泌，明顯改善了糖尿病大鼠的糖耐量情況，能夠使糖尿病大鼠的血糖在一段時(shí)間內(nèi)得到一定水平的控制。結(jié)論我們構(gòu)建的攜帶目的基因的重組腺病毒，體外和體外實(shí)驗(yàn)均可以轉(zhuǎn)染胃腸道K細(xì)胞，使其表達(dá)胰島素，能夠使糖尿病大鼠的血糖在一段時(shí)間內(nèi)得到一定水平的控制，為將來(lái)體內(nèi)人胰島素基因治療糖尿病提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

簡(jiǎn)介：華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文血管性認(rèn)知功能障礙大鼠模型血腦屏障改變與MMP9表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究姓名毛玲申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專(zhuān)業(yè)神經(jīng)病學(xué)指導(dǎo)教師梅元武20070501華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文5鼠行雙側(cè)頸總動(dòng)脈分期永久結(jié)扎制備慢性腦低灌注大鼠模型，抑制劑組鼠在行雙側(cè)頸總動(dòng)脈分期永久結(jié)扎前一天起每日腹腔注射MMPS抑制劑巴馬司他BB94，正常對(duì)照組鼠分離出頸總動(dòng)脈后不予結(jié)扎即縫合皮膚。采用HE染色法、辣根過(guò)氧化物酶HRP染色法及免疫組織化學(xué)染色法觀察模型組、抑制劑組及正常對(duì)照組鼠手術(shù)3天后海馬區(qū)錐體細(xì)胞、血腦屏障的變化及腦組織MMP9的表達(dá)。采用MORRIS水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察各組鼠手術(shù)1月后認(rèn)知功能的改變。結(jié)果結(jié)果與模型組相比，抑制劑組鼠HRP反應(yīng)產(chǎn)物和海馬區(qū)錐體細(xì)胞受損明顯減少，學(xué)習(xí)記憶功能明顯改善P＜005。與正常對(duì)照組相比，抑制劑組鼠HRP反應(yīng)產(chǎn)物、海馬區(qū)錐體細(xì)胞及學(xué)習(xí)記憶功能無(wú)明顯差異P＞005。結(jié)論結(jié)論慢性腦低灌注大鼠模型認(rèn)知功能障礙形成的過(guò)程中，MMP9表達(dá)增高，通過(guò)破壞血腦屏障，促進(jìn)海馬區(qū)錐體細(xì)胞及神經(jīng)纖維的損害，從而促進(jìn)認(rèn)知功能障礙的發(fā)生。早期使用MMPS抑制劑，可以保護(hù)血腦屏障，阻止認(rèn)知功能障礙的發(fā)展。關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞慢性腦低灌注；血管性認(rèn)知功能障礙；血腦屏障；MMP9；巴馬司他

簡(jiǎn)介：天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文高同型半胱氨酸血癥與SIVD認(rèn)知功能障礙的研究姓名張靜申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專(zhuān)業(yè)神經(jīng)病學(xué)指導(dǎo)教師張哲成20060523天津醫(yī)科人學(xué)砸．J學(xué)位論文高同型半胱氨酸血癥與SIVD認(rèn)知功能障礙的研究摘要目的研究高同型半胱氨酸血癥．HYPERHOMOCYSTEINEMIA，HHCY及葉酸、VITBL2相關(guān)因子缺乏與皮層下缺血性血管病SUBCORTJCALISCHEMICVASCULARDISEASE，SIVD不同程度認(rèn)知功能狀態(tài)的相關(guān)性，為血管性認(rèn)知功能障礙VCI探尋新的可能致病因子。方法根據(jù)血管性認(rèn)知功能狀況選取20022005年神經(jīng)內(nèi)科門(mén)診及住院SIVD患者共119例，均經(jīng)CT證實(shí)符合SIVD診斷，對(duì)所有患者行MMSE評(píng)分，按照認(rèn)知功能程度的不同分為癡呆組與非癡呆組。其中癡呆組54例，男33例，女21例，平均年齡69．57±5．25歲；非癡呆組65例，男36例，女29例，平均年齡68．20±4．42歲。兩組間性別及年齡均相匹配。對(duì)所有受試者利用高效液相色譜法?HPLC。檢測(cè)其同型半胱氨酸HCY水平，同時(shí)利用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)妞清葉酸、VITB，水平，結(jié)合血脂、血糖等生化指標(biāo)作對(duì)照研究。結(jié)果1．癡呆組血漿HCY水平分別為43．13±9．42帥OL幾，顯著高于非癡呆組20．25±6．25帥OL幾，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P0．01。2．癡呆組血清葉酸、VITB。。水平分別為3．51±1．86NG／ML、393．06±208．63PG／ML，顯著低于非癡呆組的5．86±1．38NG／ML、682．64±190．95PG／ML，P0．OL，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0．01。3．采用SPEARMAN相關(guān)方法分析，不同性別的HCY水平與蚴SE分?jǐn)?shù)均呈負(fù)相關(guān)，與年齡均呈正相關(guān)。

簡(jiǎn)介：四川大學(xué)博士學(xué)位論文腺病毒轉(zhuǎn)染核糖體蛋白基因RPS26對(duì)人結(jié)外鼻型NKT細(xì)胞淋巴瘤生長(zhǎng)分化影響的實(shí)驗(yàn)研究姓名楊帆申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別博士專(zhuān)業(yè)病理學(xué)與病理生理學(xué)指導(dǎo)教師劉衛(wèi)平20060501●●PCRPTKSRTPCRRTQPCRPOLYMERASECHAINREACTION聚合酶鏈反應(yīng)PROTEINTYROSMEKINASES蛋白酪氨酸激酶REVERSETRANSCRIPTIONPOLYMERASECHAINREACTION轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)REALTIMEQUANTATIVEPOLYMERASECHAINREACTION實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)RPMREVOLUTIONSPERMINUTE轉(zhuǎn)／分RPMI1640RPMI1640MEDIUM1640培養(yǎng)基RPFRIBOSOMALPROTEIN核糖體蛋白R(shí)PGRIBOSOMALPROTEINGENE核糖體蛋白基因RPSL3RIBOSOMALPROTEINGENES13核糖體蛋白基因S13RPS26RIBOSOMALPROTEINGENE26核糖體蛋白基因26SEESECOND秒SPSTREPTAVIDINPERIOXIDASECONJUGATEDMETHODSSCTBETCRTETHSSODIUMCHLORIDE／SODIUMCITRATETRISBORONATEEDTABU丘打TCELLRECEPTORTRISEDTABUFFERTRISHYDROXYMETHYLAMMOMETHANE鏈親和素過(guò)氧化物酶法氯化鈉枸櫞酸鈉緩沖液TRIS硼酸乙二胺四乙酸緩沖液T細(xì)胞受體“IRIS乙二胺四乙酸緩沖液三羥甲基氨基甲烷

簡(jiǎn)介：點(diǎn)擊查看更多登革病毒及其部分蛋白對(duì)宿主細(xì)胞氧化還原狀態(tài)影響的初步研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡(jiǎn)介：呼吸道病毒是一組能夠通過(guò)呼吸道引起呼吸系統(tǒng)或及其他系統(tǒng)疾病的病毒病原。呼吸道病毒的傳播方式?jīng)Q定了容易引發(fā)大流行如流感病毒和SARS病毒感染，對(duì)這類(lèi)病毒的快速檢測(cè)對(duì)于采取有效的防范和治療措施極為重要。本研究首先建立了重要呼吸道病毒病原的多重PCR檢測(cè)方法。多重PCR是在同一反應(yīng)管中完成多個(gè)不同的基因擴(kuò)增反應(yīng)，可快速同時(shí)檢測(cè)多種病毒。呼吸道病毒種類(lèi)眾多，且臨床癥狀相似，多重PCR技術(shù)適于此類(lèi)病毒的檢測(cè)。本研究首先建立了可檢測(cè)三種重要的呼吸道病毒，即甲型流感病毒IA、呼吸道合胞病毒RSV和SARS冠狀病毒SARSCOV的多重PCR方法。敏感性分別為10TCIDML、10TCIDML和10TCIDML。與此同時(shí)還建立了可檢測(cè)三種重要致呼吸系統(tǒng)疾病的2、3和7血清型腺病毒的多重PCR方法，敏感性為001～1TCIDML。本研究所建立的多重PCR方法可在6小時(shí)內(nèi)完成，適用于待檢主要呼吸道病毒的快速甄別。實(shí)時(shí)定量PCR具有快速，減少污染和準(zhǔn)確定量的優(yōu)點(diǎn)，和多重PCR相結(jié)合不僅能夠快速同時(shí)檢測(cè)多種病毒，而且由于減少了酶和熒光染料或探針的使用量更降低了檢測(cè)成本。本研究針對(duì)多重PCR檢測(cè)的IA、RSV和SARSCOV，采用SYBRGREENI熒光染料法進(jìn)行多重實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。敏感性分別為10TCIDML、1TCIDML和10TCIDML，敏感性總體上高于普通多重PCR，而與普通多重PCR具有同樣良好的特異性。SARSCOY的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)需在BSL3級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。本研究建立了基于重組、克隆表達(dá)特異抗原的SARSCOV間接免疫熒光IFA檢測(cè)方法。通過(guò)獲得可穩(wěn)定表達(dá)SARSCOVN蛋白的重組細(xì)胞系，采用IFA方法對(duì)SARSCOV感染的血清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，從而避免可能由該病毒引起的實(shí)驗(yàn)室感染或由于缺乏BSL3級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室而造成的檢測(cè)條件限制。同時(shí)，通過(guò)制備抗原片，可在3小時(shí)內(nèi)在免疫熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，從而為快速、安全檢測(cè)SARSCOV感染提供了有效手段。