簡(jiǎn)介：點(diǎn)擊查看更多腺病毒介導(dǎo)的骨形態(tài)蛋白-9基因轉(zhuǎn)染脂肪干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡(jiǎn)介：第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文丙型肝炎病毒F蛋白抗原性、抗凋亡作用及細(xì)胞內(nèi)磷酸化研究姓名邵圣文申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別博士專業(yè)微生物學(xué)指導(dǎo)教師戚中田20070501

簡(jiǎn)介：研究背景和目的血管再生性治療已成為當(dāng)前冠心病治療基礎(chǔ)和臨床研究的熱點(diǎn)。如能在心肌缺血發(fā)生后的恰當(dāng)時(shí)間內(nèi)使血管再生，形成或開放冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)，就可以挽救頓抑心肌，減輕心肌缺血，減少心肌細(xì)胞的死亡數(shù)量，從而保護(hù)心臟功能，改善病人的臨床癥狀和預(yù)后。四跨膜蛋白超家族（TRANSMEMBRANE4SUPERFAMILY，TM4SF）成員CD151能與多種整合素亞型特異性結(jié)合形成CD151整合素復(fù)合體，是整合素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的跨膜連接器，也是多種整合素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的交匯點(diǎn)。隨著整合素與血管生成方面研究的不斷深入，CD151也日益受到關(guān)注。研究證實(shí)CD151參與調(diào)節(jié)細(xì)胞多種功能，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)、黏附、遷移、半橋粒結(jié)構(gòu)的形成，及與整合素相互作用介導(dǎo)血管生成等。前期研究中，我們將攜帶CD151基因的重組腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染大鼠后肢缺血模型，發(fā)現(xiàn)后肢微血管密度及運(yùn)動(dòng)耐力明顯高于未轉(zhuǎn)染CD151組，初步確定了CD151在體內(nèi)促血管生成的作用；進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，利用裸質(zhì)粒注射的方法在心肌梗死模型大鼠心肌中轉(zhuǎn)染CD151，發(fā)現(xiàn)CD151可明顯促進(jìn)梗死后心肌中微血管的生成。這一系列的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明增強(qiáng)CD151的表達(dá)能夠促進(jìn)缺血組織的血管生成。但新的研究提示僅促進(jìn)微血管形成并不能改善血流灌注，血液的流通更傾向于依靠動(dòng)脈血管而不是微血管。那么，通過(guò)增強(qiáng)CD151的表達(dá)促進(jìn)缺血組織的血管生成，是否能夠促進(jìn)有效的血運(yùn)重建并改善缺血組織器官功能以及其促血管生成的機(jī)制如何，均還需進(jìn)一步研究。我們?cè)O(shè)計(jì)本課題是建立在CD151的研究成果上，觀察CD151促血管生成的有效性，即是否促進(jìn)了功能性的血運(yùn)重建，并進(jìn)一步探討其促血管生成的機(jī)制。研究方法1構(gòu)建PAAVCD151、PAAVANTICD151重組質(zhì)粒及PAAVGFP對(duì)照質(zhì)粒。質(zhì)粒擴(kuò)增、提取，氯化銫梯度離心法純化質(zhì)粒。采用三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染法包裝CD151、ANTICD151和GFP重組腺相關(guān)病毒（RECOMBINANTADENOASSOCIATEDVIRUS，RAAV）。21月齡小型豬22頭，隨機(jī)分為4組，分別為正常對(duì)照組4頭（不予冠脈結(jié)扎和注射病毒，正常喂養(yǎng)），RAAVGFP組6頭（結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，心肌內(nèi)分10點(diǎn)注射11012VIRONPARTICLES的RAAVGFP病毒），RAAVCD151組6頭（結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，心肌內(nèi)分10點(diǎn)注射11012VIRONPARTICLES的RAAVCD151病毒），RAAVANTICD151組6頭（結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，心肌內(nèi)分10點(diǎn)注射11012VIRONPARTICLES的RAAVANTICD151病毒）。轉(zhuǎn)染8周后，RTPCR、WESTERNBLOT免疫印跡和免疫組化法檢測(cè)心肌中CD151的蛋白表達(dá)及MRNA水平，免疫組化法檢測(cè)微血管密度和小動(dòng)脈密度，左冠狀脈造影評(píng)價(jià)側(cè)支循環(huán)的建立，13NNH3PET顯像評(píng)價(jià)心肌灌注，超聲心動(dòng)圖進(jìn)行小型豬心臟射血分?jǐn)?shù)（EF）、短軸縮短率（FS）及室壁厚度的測(cè)定，評(píng)價(jià)心功能。此外，WESTERNBLOT檢測(cè)FAK、PI3K、AKT、ENOS、ERK、P38MAPK等信號(hào)通路蛋白表達(dá)，亞硝酸還原酶法測(cè)定心肌組織NO含量。3將構(gòu)建含有正反義CD151基因的重組腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染ECV304細(xì)胞，MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖能力，BOYDEN小室法測(cè)定細(xì)胞的遷移能力，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞種植在MATRIGEL上，觀察其類微血管結(jié)構(gòu)的形成情況。WESTERNBLOT檢測(cè)CD151及ERK、P38MAPK的蛋白表達(dá)。同時(shí)，進(jìn)一步觀察ERK、P38MAPK信號(hào)抑制劑對(duì)CD151誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、遷移、類微血管形成的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1成功建立了小型豬心肌梗死模型。病毒轉(zhuǎn)染8周后，心肌組織CD151MRNA水平及蛋白表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組和RAAVGFP組（P2高表達(dá)的CD151能夠促進(jìn)ECV304細(xì)胞的增殖、遷移和類微血管結(jié)構(gòu)形成，高表達(dá)的CD151能夠上調(diào)磷酸化ERK的表達(dá)，對(duì)磷酸化P38MAPK的蛋白表達(dá)影響則不大。ERK抑制劑（PD098059）能顯著減弱CD151誘導(dǎo)的ECV304細(xì)胞的增殖、遷移和類微血管結(jié)構(gòu)的形成，但P38MAPK抑制劑（SB203580）則對(duì)CD151誘導(dǎo)的ECV304細(xì)胞的增殖、遷移和類微血管結(jié)構(gòu)的形成無(wú)顯著影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)論1高表達(dá)的CD151能促進(jìn)缺血心肌微血管和小動(dòng)脈的生成、促進(jìn)側(cè)支循環(huán)的建立、增加缺血心肌的血流灌注、明顯改善心功能。2高表達(dá)的CD151能促進(jìn)FAK、PI3KAKTENOS通路、ERK通路的激活。其促血管生成的機(jī)制可能與上述通路的激活有關(guān)。3高表達(dá)的CD151能夠促進(jìn)ECV304細(xì)胞的增殖、遷移和類微血管結(jié)構(gòu)形成。其作用與ERK通路的激活有關(guān)。

簡(jiǎn)介：目的尋求一種來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉、穩(wěn)定可行的乙型肝炎病毒相關(guān)性腎炎小鼠模型之方法的建立。方法模型組和對(duì)照組BALBC小鼠各10只，經(jīng)過(guò)一周觀察后，各個(gè)小鼠尿蛋白指標(biāo)為正常，模型組小鼠經(jīng)腹腔注射臨床上確診的乙肝大三陽(yáng)患者血清，兩次每周，連續(xù)地注射四周，并自開始注射后每周兩次以試紙條法測(cè)小鼠尿蛋白，對(duì)照組以等量09％的生理鹽水代替大三陽(yáng)血清。處理同模型組。第五周全部殺掉對(duì)照組和模型組小鼠，取其腎組織做光鏡、免疫熒光和透射電鏡檢查。結(jié)果第五周末全部模型組小鼠尿蛋白為陽(yáng)性，光鏡下出現(xiàn)病變，多數(shù)為系膜增生性腎小球腎炎，病變程度為輕度到中度，部分小鼠為重度病變。并可見免疫復(fù)合物的沉積。沉積部位為腎小球的系膜區(qū)、內(nèi)皮下等。免疫熒光顯示，全部模型組小鼠HBSAG為陽(yáng)性，強(qiáng)度為。電鏡下模型組小鼠可見免疫復(fù)合物的沉積，主要沉積在系膜區(qū)和內(nèi)皮下，和光鏡的結(jié)果一致。對(duì)照組小鼠未發(fā)現(xiàn)上述病變。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M小鼠尿蛋白為陽(yáng)性，光鏡下系膜輕、中、重度增生，免疫熒光HBSAG強(qiáng)度。電鏡下可見免疫復(fù)合物主要沉積在系膜區(qū)和內(nèi)皮下，已經(jīng)基本上符合了目前乙肝腎的診斷條件，故該模型的建立是成功的。

簡(jiǎn)介：目的探討慢病毒介導(dǎo)人凝血IX因子HUMANCLOTTINGFACTIX，HFIX基因在人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞HUMANUMBILICALCDMESENCHYMALSTEMCELLS，HUCMSCS中的表達(dá)。方法重組構(gòu)建慢病毒載體GV240HFIXEGFP，行PCR鑒定和測(cè)序驗(yàn)證。以脂質(zhì)體介導(dǎo)法共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝生產(chǎn)慢病毒，實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定滴度。以不同感染復(fù)數(shù)MULTIPLEOFINFECTION，MOI感染HUCMSCS，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞感染效率，流式細(xì)胞儀檢測(cè)驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)分三組實(shí)驗(yàn)組GV240HFIXEGFP感染HUCMSCS、空載體對(duì)照組GV240EGEP感染HUCMSCS及空白組空HUCMSCS，以最適MOI感染HUCMSCS。RTPCR檢測(cè)HFIXMRNA水平，ELISA檢測(cè)FIX蛋白含量FIX∶AG及一期法檢測(cè)FIX凝血活性FIX∶C。結(jié)果制備出了滴度為2108TUML的重組慢病毒。MOI10時(shí)能高效感染HUCMSCS，感染效率為9292±632％。RTPCR結(jié)果示只有轉(zhuǎn)染組有HFIXMRNA轉(zhuǎn)錄。感染后1D，HUCMSCS即可有效分泌HFIX，在5D時(shí)達(dá)到最高峰，F(xiàn)IX∶AG為8718±086NG10624HFIX∶C為443±32％，這樣高水平分泌可至少持續(xù)29D。結(jié)論重組GV240HFIXEGFP慢病毒能有效感染HUCMSCS，并在其子代細(xì)胞中高效表達(dá)具有凝血活性的HFIX蛋白，為HUCMSCS成為血友病A基因治療的細(xì)胞載體研究奠定了基礎(chǔ)。

簡(jiǎn)介：目的探討Β糖蛋白IΒGLYCOPROTEINI，ΒGPI基因在BACTOBAC桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)。方法提取人正常肝臟組織的TOTALRNA，根據(jù)GENEBANKNM000042報(bào)道的ΒGPI的基因序列，通過(guò)RTPCR擴(kuò)增ΒGPI基因，將其克隆到供體質(zhì)粒PFASTBACHTA中，通過(guò)。DHL0BAC菌篩選、鑒定并抽提獲得高純度的重組穿梭載體BACΒGPI，并脂質(zhì)體介導(dǎo)將重組穿梭載體轉(zhuǎn)染SD細(xì)胞，獲取并擴(kuò)增重組病毒。提取轉(zhuǎn)染的昆蟲細(xì)胞的TOTALRNA，通過(guò)RTPCR鑒定ΒGPI基因在RNA水平的表達(dá)。結(jié)果1構(gòu)建了攜帶ΒGPI基因的重組供體質(zhì)粒PFASTBACΒGPI，經(jīng)雙酶切鑒定和序列分析證實(shí)ΒGPI基因已正確插人供體質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)。2構(gòu)建了攜帶ΒGPI基因的重組穿梭載體。BACΒGPI，經(jīng)PCR鑒定分析證實(shí)ΒGPI基因已正確轉(zhuǎn)座插人穿梭載體的轉(zhuǎn)座接觸位點(diǎn)。3成功轉(zhuǎn)染SF9細(xì)胞，鑒定了ΒGPI基因的RNA水平的表達(dá)。結(jié)論成功構(gòu)建了ΒGPI的昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體，并證實(shí)了ΒGPI基因在RNA水平的成功表達(dá)。

簡(jiǎn)介：簡(jiǎn)單重復(fù)序列SIMPLESEQUENCEREPEATSSR的生物信息學(xué)分析是研究基因組進(jìn)化、蛋白質(zhì)功能以及遺傳和環(huán)境相互作用等課題中一個(gè)的重要環(huán)節(jié)。相關(guān)研究表明簡(jiǎn)單重復(fù)序列SSR在大多數(shù)真核生物的基因組中是普遍存在的且重復(fù)次數(shù)因物種而不同。SSRS具有很高的可變性、顯著的多態(tài)性和相對(duì)保守性的側(cè)翼序列一般為共顯性遺傳其種類和數(shù)量還可能對(duì)翻譯活動(dòng)的水平產(chǎn)生影響并且與基因組的進(jìn)化相關(guān)。SSRS高度的可變性可能是在DNA復(fù)制、修復(fù)或重組過(guò)程中鏈的滑移錯(cuò)配引起的。隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)SSRS能夠影響生物體中染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)、基因活性的調(diào)控、DNA的重組及錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)并在生物的進(jìn)化過(guò)程中起著非常重要的作用。近年來(lái)對(duì)于流感病毒的相關(guān)研究不少涉及基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、流行病學(xué)等諸多領(lǐng)域但對(duì)于不同宿主的甲流病毒基因組中簡(jiǎn)單重復(fù)序列的相關(guān)研究卻未見報(bào)道。本文對(duì)甲流病毒基因組中簡(jiǎn)單重復(fù)序列進(jìn)行了生物統(tǒng)計(jì)分析探索甲流病毒基因組中簡(jiǎn)單重復(fù)序列的分布規(guī)律以及產(chǎn)生分布規(guī)律變化的因?yàn)?。流行性感冒是由流感病毒INFLUENZAVIRUSIV所引起的一種流行性疾病。流感病毒屬正粘液病毒科流感病毒屬包括甲、乙、丙三型其中以甲型流感病毒所引起的流行性感冒危害最大。本文從編碼血凝素HEMAGGLUTININHA的基因作為研究對(duì)象入手用生物統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)其基因序列中SSRS進(jìn)行分析。分析結(jié)果表明甲流HA核苷酸序列中SSRS的分布存在一定的規(guī)律性其相對(duì)豐度值與相對(duì)密度值存在很高的相似性這些高相對(duì)豐度值和高相對(duì)密度值表明SSRS可能與HA基因極易發(fā)生點(diǎn)突變相關(guān)。其中的一些序列顯示出對(duì)一些普遍出現(xiàn)的SSRS和一些較長(zhǎng)SSRS的偏好性。我們推斷甲流HA序列可能對(duì)富含腺嘌呤ADENINEA堿基的重復(fù)單元具有一定的堿基偏好性。而SSRS越長(zhǎng)它整體重復(fù)單元的突變率可能越高而穩(wěn)定性也可能會(huì)越低。這可能是越長(zhǎng)的SSRS所承受的環(huán)境選擇壓力越大和突變結(jié)果的穩(wěn)定性越低導(dǎo)致了不可能在較小的HA序列中出現(xiàn)超長(zhǎng)的SSRS。另?yè)?jù)分析報(bào)道在HIV病毒中SSRS也存在類似現(xiàn)象。比較兩種分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然二者都是病毒但甲流病毒HA序列中卻存在著大量的SSRS尤其是大量的單堿基SSR的存在說(shuō)明在HA序列中單堿基SSR異常活躍。但二堿基SSR相對(duì)較少這說(shuō)明在甲流病毒種間SSRS的分布各有堿基重復(fù)單元的偏好性。

簡(jiǎn)介：目的使用1HMRS觀察電針對(duì)輕度認(rèn)知功能障礙患者認(rèn)知功能的干預(yù)效應(yīng)，并客觀評(píng)價(jià)此法的臨床療效。方法32例腎精虧虛型輕度認(rèn)知功能障礙患者，隨機(jī)分為兩組。電針組采用補(bǔ)腎填髓針刺法并接電針；對(duì)照組采用鹽酸多奈哌齊片劑口服，10天為一個(gè)療程，三個(gè)療程后觀察療效。結(jié)果神經(jīng)心理學(xué)量表評(píng)分電針組治療前后MMSE和CMS得分比較具有顯著性差異P結(jié)論電針腎俞、懸鐘、四神聰?shù)妊?，可改善腎精虧虛型輕度認(rèn)知功能障礙患者的總體認(rèn)知能力。電針可延緩腦內(nèi)代謝物NAA的降低，并可在一定程度上提高NAA含量，表明電針可能通過(guò)修復(fù)神經(jīng)元達(dá)到改善認(rèn)知功能的作用；電針還可減少腦內(nèi)代謝物MI的含量，表明電針可能通過(guò)減少神經(jīng)膠質(zhì)的生成，達(dá)到改善認(rèn)知能力，延緩衰老的作用。

簡(jiǎn)介：該研究設(shè)計(jì)以小鼠PⅣ型CⅡTAMRNA為模板的反義片段片段全長(zhǎng)為431BP覆蓋了起始密碼子上游22個(gè)堿基及閱讀框5端409個(gè)堿基也包含了第一外顯子和第二外顯子間的剪接位點(diǎn)用常規(guī)分子生物學(xué)方法構(gòu)建了反義片段的腺病毒表達(dá)載體PADEASY1系統(tǒng)腺病毒載體經(jīng)HEK293細(xì)胞包裝產(chǎn)生含反義片段的重組腺病毒ADCⅡTA用氯化銫密度梯度離心法獲得純化的高滴度腺病毒采用多種方法對(duì)重組腺病毒進(jìn)行了定量檢測(cè)與活性評(píng)價(jià)并將ADCⅡTA分別感染HELA細(xì)胞與P388D1細(xì)胞觀察其對(duì)誘導(dǎo)型與組成型MHCⅡ類分子表達(dá)的抑制用純化的豬心肌肌凝蛋白免疫BALBC小鼠誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎動(dòng)物模型的產(chǎn)生并分別于免疫后02天與1416天經(jīng)尾靜脈注射重組腺病毒觀察ADCⅡTA對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎的預(yù)防與治療效果第一部分?jǐn)y帶小鼠MHCⅡ類分子反式作用因子基因反義片段的重組腺病毒載體的構(gòu)建第二部分重組腺病毒的純化與定量檢測(cè)第三部分腺病毒介導(dǎo)反義CⅡTA基因轉(zhuǎn)移抑制MHCⅡ類分子表達(dá)的體外研究第四部分重組腺病毒ADCⅡTA介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎的防治在該研究中我們使用的ADCⅡTA在不同病理時(shí)期對(duì)EAM進(jìn)行治療均取得了較好的效果這為臨床治療自身免疫性心肌炎提供了有意義的啟示因?yàn)镋AM與人類心肌炎的病理過(guò)程十分相似但是我們也注意到人類心肌炎大多由嗜心性病毒引起目前認(rèn)為病毒并非是造成心肌炎病理?yè)p傷的直接原因一過(guò)性的病毒感染導(dǎo)致受染心肌細(xì)胞釋放肌凝蛋白等自身抗原觸發(fā)自身免疫反應(yīng)導(dǎo)致更為嚴(yán)重的心肌細(xì)胞損傷因此心肌炎實(shí)質(zhì)上是一種自身免疫功能失常機(jī)體各種免疫細(xì)胞參與的自身免疫性疾病盡管該疾病的急性階段與EAM相異位慢性活動(dòng)性階段的免疫損傷卻與EAM殊途回歸因此我們認(rèn)為ADCⅡTA對(duì)嗜心性病毒感染導(dǎo)致的心肌自身免疫損傷也具有一定的治療作用可以通過(guò)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)

簡(jiǎn)介：目的通過(guò)本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究，觀察心安顆粒對(duì)免疫性心肌損傷的動(dòng)物的免疫器官（胸腺、脾臟）、巨噬細(xì)胞的吞噬功能，紅細(xì)胞溶血素、溶血空斑、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、IGA、IGG、IGM及T細(xì)胞亞群的影響，并初步探討心安顆粒防治病毒性心肌炎（VMC）作用機(jī)理。方法將昆明小鼠按體重隨機(jī)分為五組，分別是正常對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、心安顆粒大中小劑量組。每組10只，各組給予相應(yīng)藥物灌胃處理，并于實(shí)驗(yàn)第14日處死動(dòng)物，分別檢測(cè)其胸腺和脾臟重量、巨噬細(xì)胞吞噬百分率和指數(shù)、紅細(xì)胞溶血素值、溶血空斑數(shù)、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率IGA、IGG、IGM及T淋巴細(xì)胞亞群指標(biāo)（CD3、CD4、CD8）。結(jié)果（1）各組治療與對(duì)照組比較在對(duì)免疫器官重量、巨噬細(xì)胞吞噬功能、紅細(xì)胞溶血素生成、溶血空斑形成、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、IGA、IGG、IGM及T淋巴細(xì)胞亞群（CD3、CD4、CD8）的影響中，各治療組明顯優(yōu)于正常對(duì)照組（P005、P001），提示各治療組都具有非特異性和特異性免疫功能；（2）心安顆粒大中小劑量與黃芪精口服液比較心安顆粒各劑量組對(duì)小鼠各方面免疫機(jī)能均有增強(qiáng)作用，但大劑量組作用明顯高于中小劑量組而與同劑量的黃芪精口服液組作用相似。說(shuō)明心安顆粒劑量影響小鼠免疫功能，即心安顆粒與小鼠免疫機(jī)能增強(qiáng)之間存在劑量效應(yīng)關(guān)系。結(jié)論（1）心安顆粒能顯著增加小鼠免疫器官（胸腺、脾臟）重量，提高巨噬細(xì)胞吞噬百分率和吞噬指數(shù)，促進(jìn)溶血素及溶血空斑形成，促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，提高IGG、IGM及T淋巴亞群（CD3、CD4、CD8）；（2）心安顆粒有較好的免疫興奮作用。

簡(jiǎn)介：本論文由三部分組成湖南省感染巨細(xì)胞病毒嬰幼兒臨床病毒分離及流行病學(xué)調(diào)查；HCMV包膜糖蛋白B（GB）基因型分析；臨床分離株抗病毒藥物的耐藥性分析。（一）將臨床有癥狀，HCMVDNA拷貝數(shù)≥103～107ML的0～1歲的嬰幼兒尿液接種于人胚肺（HEL）細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)尿液接種出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）的患兒母子進(jìn)行IGG、IGM統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)患兒的血常規(guī)、生化指標(biāo)以及疾病類型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明先天性感染以神經(jīng)腦損傷為主，嬰兒出生后出現(xiàn)大腦發(fā)育畸形，智力低下，二側(cè)神經(jīng)性耳聾伴隨運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性障礙等癥狀。HCMV感染引起嬰幼兒肺炎、肝炎、腎炎、腸炎及貧血。（二）隨機(jī)抽樣CPE陽(yáng)性的8株病毒，提取全部基因組，通過(guò)套式聚合酶鏈反應(yīng)（NPCR），加限制性長(zhǎng)度多態(tài)性分析（RFLP），對(duì)各臨床株病毒GB進(jìn)行亞型分析，探討了湖南省嬰幼兒臨床病毒株的GB基因型分布，以及GB基因型與疾病類型的關(guān)系，對(duì)UL55基因目的片段進(jìn)行基因測(cè)序，并進(jìn)行了序列分析和同源性比較。結(jié)果顯示我省嬰幼兒HCMV感染以GB1型為主；8株HCMV臨床分離株的同源性高達(dá)985％。與HCMVAD169及TOWNE株的DNA序列比較，它們之間的序列相似性分別達(dá)到948％和970％（三）抽取嬰幼兒臨床株進(jìn)行耐藥性分析（1）表現(xiàn)型方法測(cè)定對(duì)HEL細(xì)胞培養(yǎng)CPE陽(yáng)性臨床敏感株，觀察對(duì)更夕洛韋、磷甲酸鈉和黃芪的藥物敏感情況，結(jié)果表明HCMV臨床病毒株對(duì)更昔洛韋≥625UGML和膦鉀酸鈉≥50UGML敏感，黃芪在細(xì)胞水平上對(duì)病毒復(fù)制沒(méi)有抑制作用。（2）基因型方法測(cè)定對(duì)UL54目的片段進(jìn)行基因序列分析，發(fā)現(xiàn)幾個(gè)氨基酸的突變均發(fā)生在Ⅳ～ΔC區(qū)或Ⅱ區(qū)～ΔC區(qū)的區(qū)段間隔中。

簡(jiǎn)介：、IU二2234洳≯理乒大學(xué)ZHEJIANGSCITECHUNIVERSITY碩士學(xué)位論文論文題目學(xué)科專業(yè)作者姓名指導(dǎo)教師完成日期遽盎罐盎趙越毖￡趔塑蘊(yùn)班瘟逝復(fù)麴亟塑趁盎嵫縊趄亟I孟噬衛(wèi)定盛逖浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文關(guān)鍵詞病毒基因治療，RNAI，XIAP，TRAILIL

簡(jiǎn)介：YL2；L蠡330分類號(hào)．泰山屋爹琵碩士研一究生學(xué)位論文論文題目依達(dá)拉奉對(duì)慢性腦缺血鼠認(rèn)知功能障礙與TGF．PI、BCL一2、MDA、SOD陽(yáng)性表達(dá)影響的研究系醫(yī)院、所濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院研究生姓名劉眷寒學(xué)科、專業(yè)內(nèi)科學(xué)研究方向神經(jīng)病學(xué)指導(dǎo)教師薛慎伍教授入學(xué)時(shí)間2004年9月論文工作起止時(shí)間2005年11月～2007年4月原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過(guò)的科研成果。對(duì)本文的研究作出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人完全意識(shí)到本聲明的法律責(zé)任由本人承擔(dān)。論文作者簽名亟L盔塑墜．日期鯊Z二魚二蘭笪關(guān)于學(xué)位論文使用授權(quán)的聲明本人完全了解泰山醫(yī)學(xué)院有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留或向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱；本人授權(quán)泰山醫(yī)學(xué)院可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或其它復(fù)制手段保存論文和匯編本學(xué)位論文。保密論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定論文作者簽名主L盤鍪導(dǎo)師簽名盔選墨垂日期型．．2‘

簡(jiǎn)介：登革病毒DENGUEVIRUS是人類登革熱DF、登革出血熱登革休克綜合征DHFDSS的病原體。登革病毒感染嚴(yán)重威脅全球近半數(shù)人的健康，然而時(shí)至今日仍然沒(méi)有有效的治療藥物和疫苗，因而探索抗登革病毒感染的新策略成為當(dāng)今登革研究的熱點(diǎn)。登革病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS3，其編碼基因在黃病毒中具有高度的保守性，基因全長(zhǎng)1854BP編碼618個(gè)氨基酸，是病毒編碼的第二大蛋白。NS3是一種多功能蛋白，N端具有SER蛋白酶活性，C端具RNA解旋酶及NTPASE、5′RNA三磷酸酶等活性，參與病毒前體的加工和病毒RNA的復(fù)制及基因組RNA的5′端加帽。該蛋白具有很好的免疫原性，并存在特異性CD4和CD8識(shí)別表位，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。鑒于NS3同時(shí)具有病毒復(fù)制所必需的多種酶活性及其良好的免疫原性，其已成為登革抗病毒藥物設(shè)計(jì)的重要靶標(biāo)。本研究工作分為以下三個(gè)部分1DENNS3表達(dá)體系的構(gòu)建提取感染登革2型病毒的C636細(xì)胞總RNA，RTPCR擴(kuò)增目的基因，雙酶切后連入表達(dá)載體，構(gòu)建重組表達(dá)載體PET32ANS3、PET28ADNS3，轉(zhuǎn)化宿主菌BL21DE3，IPTG誘導(dǎo)，SDSPAGE和免疫印跡鑒定表達(dá)蛋白。通過(guò)優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件，NS3蛋白NTPASERNA解旋酶結(jié)構(gòu)域DNS3在大腸桿菌中獲得可溶性表達(dá)。2重組蛋白NTPASE活性和抗原性分析表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)親和層析純化，超濾濃縮脫鹽，孔雀綠鉬酸銨法檢測(cè)NTPASE活性。純化產(chǎn)物經(jīng)測(cè)定具有良好的NTPASE活性及抗原性，DNS3對(duì)其底物ATP、CTP、GTP、UTP存在不同的底物親嗜性。體外條件下，發(fā)現(xiàn)登革2型病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS5RDRP及POLYA對(duì)DNS3的ATPASE活性有促進(jìn)作用，提示在病毒復(fù)制時(shí)，NS3與NS5間的相互作用可能對(duì)NS3的NTPASE活性有調(diào)控作用。3NS3蛋白小分子結(jié)合肽的篩選以NS3蛋白為配體，從噬菌體隨機(jī)多肽文庫(kù)中，篩選出能與NS3蛋白NTPASERNAHELICASE結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合的短肽分子，進(jìn)行了3輪“吸附洗脫擴(kuò)增”的篩選。從第3輪篩選后得到的噬斑中隨機(jī)挑選20個(gè)克隆，用ELISA法測(cè)定上清液中噬菌體與DEN2DNS3結(jié)合活性。其中有8株ELISA的吸光度值較高。從篩選得到的陽(yáng)性克隆菌株提取單鏈DNA，進(jìn)行DNA序列測(cè)定并推導(dǎo)這些DNA序列編碼的氨基酸殘基，即為噬菌體遞呈的肽序列。本實(shí)驗(yàn)篩選得到肽氨基酸序列大多含有TPSSPT序列，富含絲氨酸、蘇氨酸等親水性氨基酸。實(shí)驗(yàn)所用ELISA反應(yīng)可用于半定量的測(cè)定噬菌體克隆和靶分子之間的結(jié)合能力，要真正地確定所淘選到的多肽是否具有特異結(jié)合活性，是否能作為藥物，還要在人工合成多肽之后進(jìn)行細(xì)胞、組織、動(dòng)物體等一系列水平上的進(jìn)一步測(cè)定。

簡(jiǎn)介：目的制造兔椎間盤退變模型；應(yīng)用腺相關(guān)病毒ADENOASSOCIATEDVIRUS，AAV介導(dǎo)人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子Β1HUMANTRANSFMINGGROWTHFACTΒ1，HTGFΒ1、HTGFΒ3基因體內(nèi)轉(zhuǎn)染兔退變椎間盤，觀察目的基因的表達(dá)以及單基因轉(zhuǎn)染或雙基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染對(duì)退變髓核細(xì)胞的生物學(xué)作用。方法成年新西蘭大白兔通過(guò)注射纖維結(jié)合素片段FIBRONECTINFRAGMENT，F(xiàn)NF制造椎間盤退變模型，造模后2、4、8、12周分別進(jìn)行影像學(xué)、形態(tài)學(xué)、組織學(xué)檢測(cè)，觀察造模椎間盤變化。將造模成功動(dòng)物隨機(jī)分為4組，各組分別于造模髓核內(nèi)注射RAAV2HTGFΒ1、RAAV2HTGFΒ3、RAAV2HTGFΒ1RAAV2HTGFΒ3、RAAV2EGFPENHANCEDGREENFLUESCENTPROTEIN，EGFP，自身對(duì)照組椎間盤內(nèi)注射磷酸鹽緩沖液PBS。手術(shù)后4、8、12周時(shí)，收獲各組髓核組織作組織培養(yǎng)或裂解，蛋白多糖的合成由35S硫酸鹽結(jié)合率來(lái)測(cè)定，免疫印跡WESTERNBLOT法檢測(cè)髓核Ⅱ型膠原的含量。分別于術(shù)后1周、12周觀察HTGFΒ1和EGFP的表達(dá)。結(jié)果1退變椎間盤內(nèi)注射RAAV2HTGFΒ11周后，髓核中HTGFΒ1含量較注射PBS椎間盤顯著增多；注射RAAV2EGFP椎間盤，術(shù)后12周仍可觀察到EGFP的表達(dá)。2基因轉(zhuǎn)染后4周、8周、12周，轉(zhuǎn)染。RAAV2HTGFΒ1組、RAAV2HTGFΒ3組和雙基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染組髓核組織Ⅱ型膠原和蛋白多糖的表達(dá)均較自身PBS組增高，各組均有顯著差異。轉(zhuǎn)染RAAV2EGFP組同自身對(duì)照PBS組比較沒(méi)有顯著差異；3造模后4、8、12周，雙基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染組椎間盤Ⅱ型膠原和蛋白多糖的表達(dá)高于單基因轉(zhuǎn)染椎間盤，有顯著差異。結(jié)論RAAV2介導(dǎo)的HTGFΒ1和HTGFΒ3轉(zhuǎn)染退變的椎間盤髓核細(xì)胞后，HTGFΒ1和HTGFΒ3可持續(xù)表達(dá)12周，并可有效的促進(jìn)退變椎間盤蛋白多糖和Ⅱ型膠原的合成；雙基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染具有協(xié)同效應(yīng)。